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分子生物学中常用的工具酶

已有 373 次阅读 2014-11-9 11:24 |个人分类:分子生物学|关键词:20141109 生物学 工具酶


一     限制性内切酶

        限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核算内切酶,有I、II和III 三种类型。
        I型和III型在同一种蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用和依赖于ATP的限制性切割活性。I型限制性内切酶结合于识别位点并随即切割DNA,III类则在识别位点切割DNA,分子克隆中,这两种酶不常用。
       II型内切酶是由两种酶分子组成的复合体系:一种具有限制性内切酶活性,可以在某一特定位点切割核苷酸序列,另一种为独立的甲基化酶,可以修饰同一核苷酸序列。绝大多数限制性内切酶可以识别长度为4-7个核苷酸且呈二重对称的特异序列,也有少数酶可以识别更长的序列或是简并序列。
       切割位点相对于二重对称轴的位置而已,一些酶可以在对称轴同时切割核苷酸序列,产生平端的DNA片段,而一些酶可以在对称轴两侧类似的位置上切割,产生单链突出端的DNA片段。
       影响限制性内切酶活性的因素很多,DNA制品的污染,如蛋白质、酚类、氯仿、乙醇、EDTA、SDS和高浓度盐类等均可抑制酶活性。这种抑制作用可以通过增加酶作用单位数(10-20U/ugDNA),增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。

二   连接酶
      (一)  DNA连接酶 
       DNA连接酶可以催化双链DNA分子中相邻碱基的5'-P和3'-OH间形成磷酸二酯键。
       1 T4 DNA连接酶
       从T4噬菌体感染过的大肠杆菌中分离出来的,既可以催化黏性末端的连接,也可以催化平末端的链接,催化过程需要ATP和Mg2+,在较高的NaCl浓度下(>150mmol/L)酶活性会受到抑制,它是唯一的在正常条件下有效连接平末端的DNA连接酶。
       2 大肠杆菌DNA连接酶
       修复双链DNA中的单链切口及互补的黏性末端的链接。在正常反应条件下,不能连接平末端,在连接黏性末端时可以代替T4 DNA连接酶,产生的背景低,准确性较高。聚乙二醇8000可以增加其对黏性末端的连接效率。NAD+参与催化。
      
   


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