H9细胞转染后加药出现细胞成片死亡，像是没贴紧浮起来一样，请问是怎么回事啊

ailiszhang

求各位大神告知，谢谢啦

做个好孩子

一般实验设置实验空白组，实验组和阴性对照组，筛选的药物一定是对干扰组有作用，但是对NC组没有影响的，不然结果就不好分析了，，我们课题组一般是用RFECT方法，用的合成公司的siRNA，一般都是要在NC组上面做预实验。

l19rna

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你得传代了，样细胞的基质不行了啊

ailiszhang

回复 hyde 的帖子, p) @3 f7 F" F$ r2 N

. F! @5 l, j! N3 ~这两天克隆中间出现黄黄的东西，而且边缘爬出梭形样细胞，是不是分化了呀？每次加药后的第二天细胞就会死很多，之前我会停止加药几天，这次没停药，继续加了，不知道明天细胞会不会一个不剩，目前的状态看起来不乐观，好心塞。

hyde

稳转？用病毒不是比较容易嘛。稳转就等克隆长大，但没有长在一起的时候，长在一起之后不容易杀，而且孔板的边缘也不容易杀，传代后再杀几次（我一般传几代接着杀杀，保证细胞系的纯度）。阴性对照最好找个带gfp，没有抗性的质粒，这样可以先看看电转的效果，这些细胞也不抗药，杀完为止。不一定每天换液，看细胞多不多，非常少的话我会隔天换的。

ailiszhang

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我用的载体中没有GFP，只有PURO抗性基因，做的电转，想得到稳转细胞系。) N: }& N: J) r
我还是不太明白，阴性对照就是没有做转染的正常hES吗？还有阳性对照怎么做呀？克隆大一点具体怎么来判断呢，看直径还是细胞数目呀？你们一般转染后多久加药呢？加药后是每天全换含puro的培养基吗？什么时候停止加药呢？  
5 l6 A% u& Y) @; @$ y+ Z/ P另外，如果有这方面的文献，可不可以分享一下呢？
, G5 n1 L6 k  H& W* o' W# d问题有点多，可能问得也比较白痴，还请不吝赐教，谢谢！

hyde

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阴性对照就是药杀对照，瞬转质粒停留的时间比较短，不能杀太久，对照死完了就停药。我也差不多用0.5的puro，转染的质粒带gfp标记吗，或者做个阳性对照看看转染效率吧。另外，药杀前先将克隆养大一点再杀。

ailiszhang

回复 hyde 的帖子& ], k6 y% c/ D" J
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谢谢回答。. ?% g9 c2 P( ]/ {. K
请问阴性对照是什么，有什么作用？药筛过程中还需要设其他对照吗？; x. H! p. a" r7 Q
我做的H9细胞，puromycin筛选，药物浓度最开始加的1ug/ml，死了很多，后来降到0.5ug/ml，第二天细胞就漂了一些，第三天全死了。按照实验室师姐摸索的浓度来加，细胞基本没怎么死。

hyde

药杀浓度是否摸索过，什么药物，什么浓度，hes每个细胞系对药物敏感性还是有所差异的，要事先测试一下，浓度太高会死的比较多。

hyde

药杀阴性对照是什么样子的，如果对照死的一样多说明转染的效果不好吧