诱导iPSCs 过程中的疑惑

Andyhigh

  最近，在利用TetOn 的慢病毒系统诱导猪的iPSCs，有一些疑惑想跟大家交流下！$ _3 F) f; r2 W6 ^  b! J$ r! s

+ Q5 g2 M( `6 q" W1. 载体基本元件的顺序为( T9 [, u' H% E- N3 W6 D: v$ P- E3 Z
含目的基因（OSKM）载体：Lenti-EF1α-EGFP-TRE-oct4，含rTTA的载体：Lenti-EF1α-rttA-IRES-EGFP；9 n+ Z! u- r- ?. @( e! z% P6 N$ Y
在用293T细胞系进行病毒包装时，用的各种物质的量和步骤都一样，结果发现含目的基因载体的病毒滴度明显优于含rTTA的载体的病毒滴度，想知道有哪些因素可能导致这一问题？同时在病毒包装过程中，发现有一批质粒出现了污染，重新进行无菌处理，发现细胞还是出现污染（在高倍镜下出现蠕动的小虫，有点恶心哈），想问下这又是哪出了问题（基本排除操作引起的污染）。
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2. 在进行AP染色的时候发现一种现象：! _- u# v/ K; l9 P; {) y
     对形成的克隆进行AP染色时，发现没形成明显克隆或已开始分化克隆的边缘呈现AP 阳性，而正常的克隆确呈现AP 阴性，想问下这是否有可能是由于克隆细胞密度较大，不易着色导致的嘛？后面将补充图片···( A" S  ]! }  g* E. a! l
      还有一个问题就是，是否有一种可能AP 阴性的克隆随着培养和传代，慢慢的变成了AP阳性的克隆？& R2 Z6 E& t( x0 @& l; J/ C

/ {) x+ ?  s3 K* B+ t: q3. 挑取克隆时间等问题
+ y- K. Z& I; ?& K    不知道大家是根据什么确定挑取克隆的时间的；前段时间挑取一个不规则的克隆（不呈现标准的圆形或椭圆形，体积适中）消化成单细胞至lif-2i体系和基础培养基体系中，发现前者第二天大量死亡，而后者3d时也没有形成克隆；而差不多大小的圆形克隆能支持单细胞传代；
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4. 克隆问题+ P8 ]! G7 K7 U2 M
   目前，自己获得的克隆进行单细胞传代后大概2-3d能形成克隆样（此时像小鼠iPSCs样克隆），但随着时间的推移，发现慢慢地向人iPSCs的形态发生转变；并且大部分克隆不发绿色荧光（7孔中6孔不发荧光，荧光为EGFP见载体，这能否说明外源性的OSKM已不表达，而内源性的调控网络可能激活？而最后一孔出现了一种奇怪的现象：出现了两种形态和颜色明显不一样的克隆A（跟其他6孔一样）和B（相较于A明显小一圈，且是在克隆A出现后3d左右大量出现的），其中A不发绿色荧光，而B发荧光（很强），后面将附图说明。有人帮忙推断，这有可能是细胞不纯 或 细胞癌变 导致的。并且这些克隆基本上（出现了如上AP染色问题，所以用了基本）呈现AP 阴性，但A克隆能支持单细胞传代，B克隆正在试验。& ?) y& Q6 u7 o5 u$ r$ b
   由于使用的是DOX系统，根据个人的认识，好像猪iPSCs 上这样的克隆都需外源添加 DOX等维持外源OSKM的表达，而维持克隆的未分化状态。在小鼠上，好像看到个一篇用TetOn系统诱导的克隆，在撤除Dox后，细胞还能维持未分化状态，说明其内源性的多能性调控网络已激活，但这篇文章找不到了，不知道有没有高手提供点线索。在猪上自己还没有见到过这样的文章，不知道有没有可能存在这种情况。目前，试验缺少重复，还需完善；并且图片还没拷贝出来，后面将附图，希望大家根据自己的知识解答下我的疑惑。
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8 N, K: [* S+ S- j: u  t补充内容 (2014-10-5 19:35):. q8 b& `$ `* l6 w+ f. q
今天发现 B 类克隆保持了之前克隆的形态和颜色，而A 类克隆是在 B 类 克隆进行单细胞传代后形成的克隆，目前该克隆的增殖能力还在检测当中（之前的判断有误或存在偏差，没有直接证据证明该克隆能支持单细胞传代）

Andyhigh

下面三幅图片分别 克隆形成初期 中期 后期，其中初期和后期呈现部分AP阳性，而中期为阴性
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补充内容 (2014-10-5 19:29):' X6 H: n3 ^7 e- |
图片 不是 很好 编辑和 排序

zhangweihwz

在Rudolf Jaenisch lab 所发表的iPS 文章中，使用FUW-Tet-on系统制备的iPSCs，在后期撤除Dox后，iPSCs基本上可以维持pluripotency。
6 D# F- N: ^. i' G5 l但是Dox诱导体系，并不是绝对精准调控的体系，在撤除Dox后，外源基因也可能会表达。

Andyhigh

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9 M; R" W7 h# K# I' M9 C( O3 W4 C5 D# t; P( t& p# t: [0 q3 K" Z
谢谢你的回答！. \( b3 @; q# e' G" @6 S

- i) Z& A7 G' L经过这几天的实验，发现 A  类克隆呈 AP 阳性，而B 类克隆部分呈现AP阳性，并随着B类克隆的单细胞传代，也会逐渐变成A 类克隆（部分变成）----初步判断 A 类克隆的重编程程度高于B，B是重编程过程（体细胞-A 克隆）中的一个阶段；明天上图
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同时，对A类克隆撤除DOX后，发现细胞克隆形态还能维持，且用Tryple 消化传代发现，细胞增殖速率也挺好（1:7传代，24h后能明显可到克隆，且密度较大），明天上图吧！
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还有一些检测还在进行当中，如免疫荧光染色！
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1 {& @( j% c1 D% ]! m2 n1 d$ _1 \目前的问题：9 `7 ^% e4 S4 |& i8 h
1. 不能确定A 类克隆的内源性调控网络是否建立（如OSKM的表达），不知道有什么好的方法没？？？
3 f! h2 l2 q9 m' u2. 不知道A 类克隆是否来源于猪的体细胞，还是混杂了其他的细胞（如饲养层细胞，或者细胞建系时混了一些其他细胞）；
4 x. O, l" R. j" L' m3. 实验缺乏重复，真担心再次诱导不会像第一次这么幸运。7 d$ @' \: _! Z$ F! X) x

. x% H/ E. M" J0 |# n" m; s, X还麻烦zhangweihwz 提供下 你说的文章题目，这样我好检索（最好能上传下），谢谢！
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Andyhigh

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! @, c" I: {# W  y9 @想问下是 2008年在cell stem cell 上的文章-Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells-嘛？期待你的答复，这个对我真的很重要？ 可以的话还麻烦推荐一些相关的文献，如在人 上是否有相关的案例！