求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊4 P0 a  e. o* ~# I: l' m. d2 b
培养材料：4 x9 f! T6 A: s2 G" e
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
2 e. @: S. D2 {8 p1 O  v细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）( r/ g" `7 o7 p) v8 [
操作步骤：
1 M) p5 G" }7 L. o) ?% \: k7 m1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，6 j; a8 a4 {- m; J
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
+ ]; i( ^9 N" _  R7 n1 V, W3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
3 w; d2 W& O5 U9 V4 S4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。, ?! u8 q) Q% q8 Y- n  I6 }
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
! Y: C" I9 M) u% }* s7 ?

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

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- q% r! @/ ~7 Z. {  b0 X& K3 b  S# t# q5 L  B
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子: O, Q. e& ^5 R0 w6 j# i: u- y! j
# p+ ?- v. G* f0 t- Q8 K
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子. n6 o' B8 k1 [; h2 X

' I0 k" J. S; M. R0 W/ d6 P2 A请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子. ]- F, t( n, X# B  a# j6 I

, Q) ]# t. S6 L: G) E细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 ; H6 ^' B% ]: o" K6 w. U  u3 f
回复 wind789 的帖子
& I9 y# |; A1 X% N5 ]1 v/ r, b2 ~4 R1 x5 G6 J5 a3 h2 U
20%左右

/ L9 _* Z! ~8 D8 [6 f
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

) b6 ^  v- A- K" Q+ A* M- u
9 p5 D, k7 P; M
回复 yangpan521 的帖子
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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells( r# `6 T- }1 d
http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood4 g( ]2 z+ ?5 E  V1 a% M" G
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方案：
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, C) B) q0 B$ {' n* G0 t物料：