关于脐血分离造血干细胞的有核细胞回收率，大家能不能说点什么？

lql2006wh0

我们使用常用的HES（羟乙基淀粉，分子量是常用的，具体记不得了）方法沉降红细胞，然后经过两次离心（50g→500g）分离获得造血干细胞，HES比例、离心参数与文章中完全相同，但是有核细胞回收率很少达到文章中所说的超过90%，而且同时操作多个血的话，他们之间回收率也常有较大差异，大侠们能否帮我分析下问题出在什么地方？大侠们做的血是用什么方法，效果都怎样？谢谢各位。* R4 U8 u% [0 l9 j
PS：所有操作都在采血袋内进行。

刘慧瑾

至少技术方法要稳定了才行。

孙帅帅

沉降完两次离心就可以得到造血干？觉得不太可能吧！  应该还要用淋巴细胞分离液获得单个核细胞，在提取造血干吧！

swtarron

1.大部分是达不到90%的，一般是80%以上。0 w6 E  V  O, L- l6 r* U
2.影响回收率的因素有很多：（1）是否凝血，如果凝血的话回收率会降低的。（2）离心完成后去除红细胞和血浆的时候是怎么去除的，抽取的量是否准确，去除红细胞和血浆的过程是比较关键的步骤。（3）你在分离前抽样和计数的时候是否混匀，分离后抽样和计数同样要混匀。
! a. O3 N! z- l% M5 x) w希望对你有所帮助！

lql2006wh0

回复 swtarron 的帖子8 ^7 s7 [1 {; a1 K2 w8 V

! h$ Q" R) Z4 S, o7 }& n; f# ~) ]5 [有凝血现象的还是很少数的，即便有发生血凝块也不大；第一次离心后非常偶尔会看到红细胞层上面有层灰白的东西，不确定是不是目的细胞，然后用分浆夹去除红细胞，这个步骤一般会遗留一点血浆出不来（剩一点的时候红细胞沉淀会先出来）；第二次离心后也是使用分浆夹去血浆的；取小样的时候都是混匀了测的。7 x4 r# R  c: E* C* S! C
基本可以确定第一步离心后损失比较多，最后平均回收率比80%要低些，不知道您是怎么操作的？感谢你

zhzliang

能不能提供下这种分离方法的参考文献，谢谢！

mania7041

你好  其实你说说的就是脐血上经常用的手工分离方法，HES沉淀法，在这种方法中回收率一般是要求达到80%以上的，但是我们平时制备时都可以带到90%左右。
  ~, v" B, b+ m7 C' l! h其中影响因素有：1、离心力的选择，这是我们经过试验改进获得的$ g! Z9 }1 Q. A
                            2、第一次去除红细胞的量很关键，在最后的回收率中至关重要
( d* P" `+ G- b! }+ u, j                            3、第二次去除血浆时一定要小心，保证去除的是血浆而不是含有有核细胞的血浆
  j' J8 i, z, r" `4 V5 \                            4、最重要的还是操作，这是一个不断进步的过程
9 y% r6 h2 b9 L1 x/ y& O                           5、去血液分析以上检测应该根据你的结果影响不大

swtarron

回复 lql2006wh0 的帖子4 J6 \9 U, Y% z1 d6 ~# P7 e0 z# f
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我们的区别就是去除红细胞的方法不一样，我们去除红细胞是第一步倒置离心，然后用注射器抽取红细胞的。

lql2006wh0

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看来还是得自己慢慢摸索，但是“第一次去除红细胞的量是关键”怎么理解呢？红细胞层沉降怎样才算比较好呢，界面清晰还是跟上层的血浆有一个大概的比例？谢谢了。

lql2006wh0

回复 swtarron 的帖子% L/ d' _" N' Q/ h; L3 J
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我们这边不能做倒置离心，取小样后的针孔会往外面渗血，自然沉降还渗更别提离心了。