急求WB条带分析

angelyannan

本人提取的神经干细胞总蛋白，显的是p JNK，原本大家不都是46kd和54kd的两条带子么？我的根据maker来看最上面的是大概在54kd和46kd的位置，可是怎么下面还有两条？其中中间的两条挨得还很近，最下面的一条还比其他的都亮！本人用的是CST的抗体。谢谢帮忙分析！

cellprobe

2 X/ `, U' u2 X( c8 \5 [$ g, T% }

- D& H3 Z4 c0 c: U# ~' aWB有杂带有多种原因的：
  W+ F+ h# M7 P/ s( m/ j; l+ [
! t0 S! @( m7 v; f样品分解，一抗特异性不好或者浓度太高，PVDF膜封闭不够彻底，抗体没有四度过夜，或者上样品太高等

naturehu

1.多克隆抗体，抗体的特异性较差；
/ K* d' K5 A# n) \5 {% L1 O2.调整抗体浓度，降低1抗浓度试试；
3 r$ N" Z/ U- f7 d+ c, m3.延长封闭时间；: l& L2 h. H8 u3 r  T7 }2 d
4.发现新的亚型，^_^。

晴斗斗

那估计是抗体问题吧，稀释倍数不对什么的，可以标二抗的时候加点脱脂奶，看看能消除杂带么？

angelyannan

回复 shuixiao 的帖子
: w, C: f: \0 U) u8 C7 X. u2 I2 a
谢谢帮忙分析，不过如何通过内参确定样本是否分解呢？我在strip过后，孵了actin作为内参，actin还是和之前做的一样，不叫均一的一条带子，没有杂带~

shuixiao

可能的原因会有很多，比如说样品分解了，抗体特异性差，实验本身条件有问题等。
& i9 v8 ^2 A& I9 k可以做个内参看看是不是样品分解，或者换一个品牌的抗体试试，看看是不是抗体的原因。如果有单抗的话，建议使用单抗。孵育抗体还是建议在4℃下，摇床上孵育过夜（速度不要太快，如果是非圆周转动的上下摆动的摇床最好，这样可以减少非特异的结合）。3 n( w) `9 t" Q; d  k
我对p JNK不了解，所以只是从做WB的本事去分析原因，分析的不到位的原因还请海涵。