小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：
" _1 E/ e: d: e$ Q7 g9 s# G$ E

2013-5-9 13:10 上传

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+ ~5 I+ S$ l/ V- H
请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？, m9 m8 ^: i& g$ _
又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图
4 \9 m) @# Q7 W- [  e9 ~: U, {

2013-5-9 13:14 上传

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* `0 e% y8 A: k' E6 j这个更是困惑了，请教大虾们

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。
! ?0 Y3 ?1 {7 e+ z2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？
! c& G4 w$ s- g5 a- l3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；
% e. ~7 T6 F5 W* j( n, e4 K* o4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。' }8 S! V9 }6 S) U5 t; ~

dyg108

回复 katysong 的帖子6 C* O( Q, O' m) S' n- W( x

# J+ G/ u9 b5 F, V; u5 g8 Q9 [非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。
9 g* D" b( z: P' R$ y

lyj-0017

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8 G8 R3 @5 P' l
' n) Z( L/ [6 ~* u4 D      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。0 v" t) M) r0 {# E4 ]* ?' e
    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。