特定启动子+GFP构建报告基因

刘森泉

想把特定的启动子与GFP连接进去病毒表达载体构成报告基因，病毒转染细胞后，观察细胞分化过程中的基因表达窗。想请教下一般用什么质粒载体？如果要筛选稳定细胞株是不是还需要加上筛选基因，还是GFP就够了？启动子一般是UCSC中查找-2000bp至+100bp吗？提取DNA对特定启动子PCR容易吗？谢谢！

懵懂干细胞

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6 ]4 C' f* A% }& I3 D9 M光是GFP好像是不太够的哦，有的细胞假阳性的表达GFP，后面会丢失的也有。当然理论上是越多标记基因越好，但是过大会给工作带来苦难，建议可以考虑加个抗性基因，NEO PAC等等，

刘森泉

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" e! q) Z  x. a% D( i+ ~谢谢建议！再请问下一般用什么载体构建比较好呢？

pingzongyunlan

其实这个跟载体关系不大，跟你所筛选的启动子有关，我曾做过类似的实验，建议可以使用pEGFP-C1,将CMV启动子换成你所用的特定启动子，启动GFP的表达，同时还存在NEO筛选标记，这样就可以筛选稳定细胞株了~-2000-+100足够~扩增启动子时需要用基因组做模板，也就意味着存在一定的困难，建议你可以预实验一下，如果一次扩出最好，如果不行可以采用重叠延伸PCR或者其他方法来分步扩增~Good luck!

芦苇浅

我以前构建过启动子的报告载体，一般来说查找-2000bp至+100bp的基因序列已经足够；当时我使用Touch Down的方法进行PCR，还是很容易扩增的，只要你的引物和模板没问题；你可以考虑一下pEGFP-1载体，这是增强型的GFP，表达效果还是不错的，上面有Kan和Neo的抗性基因，这是载体图谱。

刘森泉

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6 [3 [. y# M; Y
) y" s' e- ^2 k( X1 I3 r+ U+ y* a5 o谢谢，但是pEGFP-C1这一系列的质粒只能用于瞬转吧，转染human ESC很困难吧？

goodboy

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  v' a2 ?0 }% z* `' Z6 M7 o/ K8 z* F4 T2 j: w9 d4 A
用慢病毒载体构建质粒然后包装病毒感染
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cheetah2020

病毒转导不太了解，请知道的童鞋给普及一下。
$ l" Z& f9 h1 d( J以前做过质粒转肿瘤细胞的稳定转染系，pEGFP-C1上带有G418抗性基因，转染后用G418进行筛选，可以得到很好的效果，但筛选过程是个技术活，有兴趣可以和我深入交流。
& u* w& M- r/ v; c1 |  H0 l. |& sMSC是否适用于这种转染方式不确定，毕竟干细胞的传代能力不如肿瘤细胞。

daviddow

FUGW

pingzongyunlan

回复 刘森泉 的帖子  o0 J  b% a" `& e

, \0 ~6 k4 C0 ?$ E6 i一般用于瞬转，但是你想整合的话可以用慢病毒载体，这个可以进行基因组整合，pCDH系列载体还可以，可以查阅一下~ESC细胞转染确实是个问题，脂质体转染方法较多，所以普通载体确实较难整合，但是也不排除确实有整合的细胞，利用筛选标记进行筛选，还是可以得到稳定整合的细胞的，不过G418筛选时间较长，ESC细胞可能会扛不住，若可以选择用puro进行筛选，效果应该会好一些~仅仅是建议~