荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

7 W' ^8 ^" j5 b2 v& a! s
7 o" W7 a% G" d% u% X最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
% M. M$ D* H0 L; y! O
1 ~; d: m7 q6 `# p  n: ^看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。. \! d1 M& n9 W* q& @
不知道是否有探针数据库可以查询？9 S/ O; ]2 o1 M7 @/ f
$ A  A1 r* B$ {, u+ L- h
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？& A7 M' `% Q1 o( n6 p( q' q

0 Q. _- F$ ?  o求高人指导~2 j+ {/ v/ {% _6 v8 _

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子  H/ K% r! I5 y8 C) C0 U0 c
, w  r  O# B- o/ B( k& _8 Q  N& H
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

- }( B$ j7 V7 F% U5 @6 n
$ k( g+ v4 q1 l4 w
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。. \3 x; i6 g6 A  l# O2 f
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
8 Z1 p3 u9 F! b( H: T8 ^上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
2 H: E! W, V$ G standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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. y0 ~8 J! u+ ]. q0 M# u果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
/ |) u7 \: r/ |% b" d. F如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

; Z; Z2 S7 r, \% X
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子5 b9 {' R: x+ A6 y& Y2 ~. q( I
6 a/ s' t8 Y( y& F/ u. o
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。$ c3 I6 E: g! P9 L3 P- n  j
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。% j. T2 y5 R+ }# `/ i0 R
几点注意：
0 [* E6 r: H. j8 _9 `" R1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。, O& ~  U: d  J
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。- C! v5 l5 W( n! t' P( d
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
% d( ?; r( c$ a2 C6 C4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。, G" }( h/ c0 @" V8 R

l19rna

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5 p4 T8 F9 J5 _( ]- T
% g: w5 L/ a8 W, y. b7 L; y0 o第一次已经失败了啊，唉，呵呵