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holywater

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发表于 2012-3-5 09:45 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

本帖最后由 holywater 于 2012-3-5 09:47 编辑 " b* p1 M* b' }4 C6 d9 A
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本帖子曾经在丁香园发过，是作者本人撰写，并非转载。应版主的允许，发到这里赚点积分。2 [% s8 |/ Q+ _- Q! w) W
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序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.
为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.  l& `5 @! D& R1 U, E: @
note:这篇文章全是我个人的经验，99。9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。0 H$ b9 @- q( N  q
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
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1.材料选择。一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
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2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是：$ O6 M: L) U5 v: |7 E/ X5 q
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首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；
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其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；
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再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。4 \% }; O. v  B6 g
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Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。, z. M) ~- a, R
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注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.# W' t1 A/ y( H% a% R
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3.解剖过程一定要全程在冰上遇冷。这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hanks的无糖环境很不利。我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。没有L-15的(国内几乎没有），可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。（中途冰袋没了的是猪头）
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4.关于培养皿的问题。一般来说，6孔板是最佳选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。大于6孔板（比如6CM DISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者经验是6孔板是最佳选择。神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。& j. i7 M. _1 Y# l* D' `% E$ j  v/ Y
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关于POLY-LYS包被，我们是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。

5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16-E18）这些信息也要严格记录。处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。
一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。6 A' M2 M% \( N/ K6 l2 R. N/ {/ }
从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多说了。不过有一点要注意，不管你是用皮层还是海马，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到0.9 ]& y- }: f. u
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6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。无论皮层还是海马，上面都是有一层血管膜。注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖显微镜。胎鼠很好剥离，而新生鼠则比较难。这里千万不能粗心大意！！血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，造成神经元大量死亡；2 血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。可以说，剥离的不好不干净，实验就是失败的，不可能得到高质量的神经元。' a$ C) ~. c( z" \4 s

注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮层的细胞很多，切忌不要放太多皮层消化吹打！过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。没有详细要求的话一般是取顶端
。
从大脑到单个海马的剥离我不细说了。我现在以海马神经元为例。在所有海马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过。最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。确认后，海马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块，放置冰上准备消化，) M9 A2 v3 A6 u* m
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7：实验成败的关键之二：消化。一般来说，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。实话说，胰酶消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是--很烂！稍微不注意，就会消化过头，细胞都消化光了。而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。所以我个人不推荐胰酶。
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想做一个完美成功的消化，我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶（见附图）。笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。DNA酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止DNA缠结就好。# W6 @) d- `, F  R4 _6 n  A
木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和。缺点是一定要现配（请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。' a( D* |9 ]! N) p

消化的技巧：消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个50ml试管装着所有东西。结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。笔者的技巧是，用一个6或10CM 培养皿来消化。这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决了上述问题。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。木瓜蛋白酶很便宜请放心。消化过程是20-30分钟。由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。消化时候请在37度温箱里，每5分钟稍微摇动一下。
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注意：1）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；2）尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks，使得神经元保持营养；3）木瓜酶一定要现用现配。

再次重申：除了消化过程中要37度，其余任何时刻都是要浸泡在0度（冰浴）的液体中。消化过后可以用1ml血清终止反应（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大）。把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。整个体系静止2-3分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保留消化过的组织块6 i# `+ {5 n4 h& c- l7 c. o
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8.实验成败最关键最关键的：吹打。笔者经验是，没有必要用巴斯德管。对于胎鼠和10天之内的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。
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我们采用的是最合理的分步吹打法。每个10次吹打过后，静止2分钟。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。
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9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep™ 1.077 推荐稀释成 60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。注意：1.077被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么请换算一下稀释度）值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转（不是15000请注意）5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。而最上层最浮头，则是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差别。有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。

10.种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。记住的是，神经元原代培养是细节决定成败，任何一个环节没处理好，整个实验都会失败。
种板密度过低是非常有害的。首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。其次，胶质细胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。; }! a$ K- M' ^, e: Q: l+ A" E1 s
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密度过高也是很有害的。由于营养争抢，密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡。另外，高密度会导致细胞聚团，结果也是细胞不正常形态或者死亡，导致错误或失败的实验结果。
笔者的经验是6孔板每一个孔要有7×100000 个正好（如果是台酚蓝染色只记录活细胞，那么酌情减少密度）。注意，注意！！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，所以细胞计数一定要非常严肃认真！！！一定要所有格子都看！！如果发现计数板细胞不均匀，宁愿重新计数！！！由于接触抑制现象，适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的实验
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由于neurbasal培养液相当昂贵，所以种板时候是不用它的，而第一次换液才用。一般种板时候我们用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%马血清。注意一定要进口的。国产杂质很多会导致莫名其妙的细胞死亡。马血清会抑制神经元凋亡并且抑制胶质细胞生长（FBS也可以，但是太贵）% M& D( `6 ?5 @: j$ H( P. v5 t

种板注意事项一：种板时候的溶液推荐使用含有谷氨酸的培养液。神经元的NMDA等谷氨酸毒受体一般3天后才会出现。所以种板时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应。而这时候的谷氨酸反而是有利条件，可以促使神经元贴壁，从而提高存活率。
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注意事项二（严格注意）种板后都是要摇晃板摇匀细胞，切记！千万不能圈圈摇晃！！圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀，会直接导致实验失败。正确的摇法是左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度，千万不要让里面液体画圈！5 i& M( X  m  m/ C  x; I
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注意事项三（严格注意）种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的无血清培养液。很多paper是1小时就换液，理由是胶质细胞贴壁差，会除去。但是笔者的经验来看，这是极端错误的！1小时换液，神经元还没有完全贴壁，这时候换液会吹下很多神经元，流到孔另外一侧再贴壁，直接照成一个孔内细胞分布不均匀，从而成熟的不均匀。严格来说这种事情直接实验失败。
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笔者的经验是种板4-6小时换液，但是千万不能超过12小时。原因是：超过12小时，混在细胞悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁，而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外12小时后，胶质细胞会开始分裂，这时候就很难抑制了。笔者推荐是4小时，但是别超过8小时。4 k+ @6 ~1 L- A) t( k9 Y/ M
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注意事项四：4小时后换液时，请轻轻摇晃板几下再换。原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。然后，注意：细胞请再用没有加血清的，种板时候用的培养液清洗一次，也是要轻微摇晃，来进一步去除细胞碎片，从而得到良好的细胞生长环境。有条件也可以洗两次，但是笔者觉得一次足够。洗了之后吸干液体，换成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神经元专用无血清培养基。* T" {* V$ u' {
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对于原代培养，是细节决定成败，一个地方不够好会满盘皆输，所以请严肃对待。0 _' |( l  [* o  q' N

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（德国队的fans于凌晨）# b, s6 p2 k3 g1 j4 D7 ?' e

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下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒，请大家注意，我把回帖编辑到这里了。enjoy.

刚回答了一系列形形色色的问题，我把这个问题挑明了说。

如果您不相信 neurobasal最好的而还是坚持用DMEM之类的培养液，麻烦检查一下你们的DMEM或者MEM或者DMEM-F12的invitrogen产品序列号，到网站上检查下相应的组成公式。很多这种培养液都是含有谷氨酸，而且是mmol级的。

成熟的神经元10um的谷氨酸即可照成细胞凋亡，而谷氨酸受体4-6天就开始表达，如果胎鼠神经元经历了mmol浓度的培养液中的谷氨酸还不被毒死，那就是怪事了。% z$ e; l; Z6 E( x
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新生鼠不受这个限制，新生鼠原代培养没有有功能的 NMDA受体，& v9 I, f% T' I" C5 b. p8 k# u6 I
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最雷到我的，是板上有人用材料非常混乱，一会用胎鼠，一会用新生鼠，一会成年鼠的- y. Y* M+ `# s: U
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你们这叫对自己不负责任！ we do all cases seriously！而不是凭借肉眼观察和猜测。
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做原代培养的，首先就是收集大量背景文献，看看你的相关要求的国际公认的做法是用哪种。胎鼠和新生鼠虽然形状一样，但是神经元的功能一点都不一样，表达受体都不一样。大部分实验都是用胎鼠，而新生鼠往往用来培养测一些LTD之类的（not quite sure,文献太少），所以有人问我新生鼠的问题，我都是说你先看下背景文献是不是你搞错了。$ F- V" X! m% }- n9 y7 |' _
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而成年鼠是另外的培养方法，要求更小心仔细和特别的处理。硬套胎鼠的原代培养必然导致失败。

另外，在一些药物保护实验中，不要以为NGF就一定对神经有很大作用，笔者的经验是，想要细胞存活，FGF2是最佳选择- h$ D* I9 W# s. y5 _% o9 f+ }

但是，FGF2会导致细胞变化很大，所以还是别用在原代培养中，不过成年鼠培养一定要用FGF2。
对于一些雷到我的，我只能再次说，请收集足够的背景文章在去选择合适材料，please do it carefully and seriously!4 M3 l! u/ N# ]# I7 @: x
祝大家都能培养出健康漂亮的神经元，欢迎大家来问问题（如果是美女的话，给个电话我会很开心）

声明，除了最后一幅图是来自别的文献，前面所有的经验都是我的原创，从无数失败总结出的我认为最完美的神经原代培养。

最后提醒大家注意：nycoprep(optiprep)可能有很多浓度，但是NycoPrep™ 1.077 以前是最常用的，笔者默认的就是用这个溶液配置的密度梯度。如果您买到的不是这个密度，请换算一下。笔者当时只有NycoPrep™ 1.077在中国能买到，现在可能会有更多浓度供选择，请大家注意换算。 " D5 I; z, i  f- j$ E5 w