慢病毒包装质粒 能否共用？

刘森泉

向各位请教：慢病毒包装质粒是否能共用？我之前用公司买的慢病毒包装体系里面带的包装质粒包（pCMV-VSVG和8.91）慢病毒，不成功，但是我用了师姐的那三个包装质粒（PL1/2和VSVG）试了下，竟然包出来了。由于不是做分子这方面的不是很懂，想问下这到底取决于什么，只需要HIV病毒的几个部件齐全就可以包慢病毒吗？那到底怎么看呢？谢谢！

xiongjiedeng

  你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下
7 l. y% |' i3 O! S2 z磷酸钙转染制备慢病毒& R0 O3 I3 y  X- J( d
1、 试剂配制% m" U8 G+ |* J# X+ ]2 C4 F# |+ C
1.1  2×HBS（500ml体系）:
: {0 r/ \2 L9 B* [- k4 X样品        浓度（mM／L）        质量(g)
$ a( I9 u  O0 Q2 v% HNaCl        280mM        8.18g7 ~# r" w! v4 _9 ?8 v$ g4 U
KCl        10mM        0.375g
9 _- ?. s2 n/ X) bNa2HPO4          1.5mM        0.1g
) d) R# l7 q* [8 gglucose        12mM        1.19g
& S2 }: U3 M/ |' Q; DHEPES          50mM        5.95g1 S& B! K% P' i) ~! V) i3 Z
        配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌
" ?# F% q8 ~& k        1.2  2M CaCl2    二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml' g9 e. a- y9 U5 r1 k+ d
        2、转染步骤
/ f% `8 e/ h* @4 d" i) Y1 g        （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染! E6 E, j/ Q) Y
（2）  将下列3种组分混匀
+ t: F3 S0 q6 s/ }" s9 a1 m试剂        体质或质量- H2 g, h! I: B! A+ ]4 p
灭菌超纯水H2O        600ul
/ l6 u: ~) d$ }6 w+ D/ w8 A6 Z& I5 ~Plasmid（质粒）/ m0 n9 u9 x9 x# h
（共270ul）        cDNA（目的质粒）          12ug" p; L" A: ?, ^
        delta 8.91（包装）        9ug
% Y2 F3 r; I5 x0 W8 N        Pvsvg（保证）        6ug
9 I$ E1 u- R" V7 g2M CaCl2        132ul
+ T# X( A2 k: X$ w2 p$ ]) `) F        （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可
7 g$ T( E6 m: J; C* E（4） 48小时和96小时分别收集上清即可

songyang1987

长知识啊

164ly

同问，可否共用？

刘森泉

xiongjiedeng，您好，太谢谢你了，你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过，没有问题，但是用感受态做大抽时经常提不出来，不知道何缘故，所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒，293T细胞，我相信包病毒过程没有问题，因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗？校对下。还有，你地点在哪？可以问你要点包装质粒或者菌吗？谢谢！

xiongjiedeng

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. H0 }/ |& x5 H8 n' P
1 F3 c8 k+ ~- c7 u! H- B4 i  \我们实验室用量比较大，包装质粒都是自己大提出来的，我在长沙，你呢？

刘森泉

谢谢！我在杭州，方便给我一点吗？

Sushi_Tuang

xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57 : {0 m% ~7 p( Y$ u
你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质 ...

. W% E$ ~$ E8 U' F" M
想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗？我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP，请问也可以用这个包装系统包出病毒么？期待您的回复。谢谢

细胞海洋

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chenhuachen

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！$ X) t6 ~" l4 N  C2 F  V( i
人的或者大鼠的野生型p53都可以。