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1、取材
( f! g0 z5 k8 u: f8 E. [# z- n要挑选活力较好的部位，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
8 o/ ^& c. K4 [6 O/ `2、培养基8 N) c/ o2 d8 N7 |0 z
一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
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' L8 S5 T! D6 l6 z1 C- T/ _3、成纤维细胞的排除：( P' Y0 ]/ a4 ~, ~" k G
3.1 机械刮除法：
" h6 e7 j3 Q8 V4 B& z. H是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：* P# H. U6 l U! v" x p; V
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；, u" ]" b- R& O1 n; C: C! m
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；1 M7 u, B0 I# f; a# t3 R' N% c8 k$ `
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
* v; c5 ~4 c% {: x; w（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止0 A, U3 u! e$ [ I! s
3.2 反复贴壁法：
) h7 }( V2 b/ t, k3 C) w' d2 \+ r根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。6 b% O( ] o9 [' M7 N- c
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；9 z1 j* G% t5 T8 v
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；, @% ~' l$ S4 [1 C
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
% B2 r$ a: A; f: Z7 Y8 G: D6 E" b# |当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
; i$ V5 f6 n+ y3.3 消化排除法：* O! U T9 c5 g2 a
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
, \$ H) r3 G. l0 t1 ]; ^, V+ l+ E1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；; `0 f4 _! t `9 v1 N, e
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。9 B/ V/ w- }5 x7 \7 k* e; D
3.4 胶原酶消化法：( i0 q' J: y2 i) A
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。6 D4 J! D+ }8 {0 i6 z: F
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
1 f" Y8 @4 N/ @) z（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
6 D: J- k) m+ {( N3 e3.5 其它方法：/ q5 ?) U- G6 s$ i" _) Y6 s2 ^
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。, a2 W. R6 i6 A$ p9 S# }
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
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$ K! E: x" w! y4、操作% |" u" R4 c9 [3 M
用医用弯头剪刀剪切组织，然后用胰蛋白酶进行消化处理。4 s2 _- s5 p" k! W; w- ^% K& `, D% J
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发表于 2011-8-1 10:35
