慢病毒转染的原理及过程（个人理解，求解惑）

zerollx

最近看了一些有关慢病毒转染的文献，虽然知道其步骤，但对其具体原理及过程理解的还不是太透彻，看了文献之后有了一些心得，但同时也有一些疑问，希望大家能指点一次：( @5 K) g* J* s; \
      慢病毒包装简要程序（本论坛上有）3 M" T' y. U: I1 n# }! E0 {
第一天：' X( v4 ]" x& l; {( Q+ q% Q2 J
1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
4 n$ ?% U% K) D, m( \第二天：                       
, H$ J/ J( x6 ?  @7 _8 i- K7 f转染293FT细胞。
1 ]) W8 R6 G2 F  1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
& Y! D3 Q4 h$ l- R  X: }8 X( ?/ l2 G" f, O  2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000
8 a( A3 d& J9 n1 h  3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min        ! O. B6 v6 Y; Q( A, X
  4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
) k5 U4 Z) J2 t( B- @) a2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+   
8 t' w! `- W$ [0 ]) m   10%FBS（从此刻开始算时间）。
! v. ]& Y( h# T第三天：
, z! ^$ H5 N* K3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上. G- Y  Q( n  K9 ^5 t7 I% F
第四天：* |. c1 ?9 u2 ?; h. E8 h$ z, |
4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤， 同时再往6孔板中加入2ml完全培养基
7 d9 Z0 @* A1 H) I7 h$ \4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。! V: p# P) h; o$ c
第五天：
& t7 v* x  I4 w/ n' H: G$ u0 C5. 72h后再次收获病毒上清:将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。! I( C  s2 X: `- z- G, p3 L
6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。3 j& O& I0 r7 z# }' l
     以下为个人理解部分：“ pWPXLd-目的基因”为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的“ pWPXLd-目的基因”RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒，在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出              “ pWPXLd-目的基因”，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为“pWPXLd-目的基因”只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。5 R4 @# ]+ ~/ N/ ]1 O
        不知道这样理解对不对，请大家点评一下。。。。。6 n6 k+ [. z& `3 _8 S3 ~+ @" v

9 F, i6 \3 X6 p

温宗壮

实用，多谢

qinrui

你好

qinrui

你好

细胞海洋

回复 小兔子lp 的帖子& n1 [9 T) q! D/ E7 Z$ X

) R+ D7 H4 `6 {' K1 }) p建议你发新帖提问

小兔子lp

如果不包装病毒，直接用脂质体2000转染目的细胞，比如MEF，结果会怎样呢？目的基本是不是也能转染到MEF中去？

thinktank

不错。0 {& N& D+ j9 ^

yiyi8909

回复 zerollx 的帖子' y3 i4 q) D& m' K# m' ^0 X

2 W: _9 r$ Y8 c好像看有的说F的意思就是fast，生长速度比293T快，它们两个都是整合了SV40大T抗原。具体的也不是很清楚。5 K" n* {8 n: [( \+ j( ^* }: a
The 293FT Cell Line is derived from the 293F Cell Line and stably9 A# R4 a4 D+ o: |' g/ d
expresses the SV40 large T antigen from the pCMVSPORT6TAg.neo plasmid.7 u' x. O! @$ K+ b  V; r: R6 ^: \
Expression of the SV40 large T antigen is controlled by the human cytomegalovirus
& m9 M5 M! W8 _. H- }. c(CMV) promoter and is high-level and constitutive. Studies have demonstrated maximal virus production in human 293 cells expressing SV40 large T antigen (Naldini et al., 1996), making the 293FT Cell Line a particularly suitable host for generating lentiviral constructs using the ViraPower Lentiviral Expression System available from Invitrogen.
1 U8 J( @  }+ @" K- F# tThe 293 Cell Line is a permanent line established from primary embryonal human
, f. w4 E  i. ~, O0 E! v! f( hkidney transformed with sheared human adenovirus type 5 DNA (Graham et al.,. C$ ~: K5 C- j& o; r
1977; Harrison et al., 1977). The E1A adenovirus gene is expressed in these cells
$ J$ Z3 i5 ~  z) ]4 o# Aand participates in transactivation of some viral promoters, allowing these cells to
+ z& x6 G7 B. D. z/ o; Xproduce very high levels of protein.
8 G8 I/ P. |( }, y1 v: PThe 293-F Cell Line available from Invitrogen (Catalog no. 11625) is a fastgrowing
7 r! L2 C  O+ Jvariant of the 293 cell line, and was originally obtained from Robert Horlick at Pharmacopeia.3 e4 X8 q0 {! X0 q& X5 P+ B
这个以供参考！

芦苇浅

回复 greenjing 的帖子' {8 N' I$ R7 Y2 u/ u/ V7 j

* Q" \1 ]0 m4 t- }! a( vThere are so many factors  influncing your transduction efficiency:1. MOI too low; 2. Too much antibiotic used for  selection; 3. Cells harvested too soon after  transduction; 4. Gene of interest is toxic to cells; 5. Non-dividing cell type used etc.

芦苇浅

回复 shihuijunm 的帖子
! O, y% `; U0 @: \4 I3 w# b# v* ^) M, q
The 293FT Cell Line, a derivative of the 293F Cell Line, stably and constitutively expresses the SV40 large T antigen from pCMVSPORT6TAg.neo and must be maintained in medium containing
, _4 P: F4 H; w8 `1 `# sGeneticin. So it's different from the 293 T cell line. + Q3 m2 k& r4 G: l* @
Best regards!