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1.MEF的获取:(步骤4-12已经进行实践), } I1 o' H) d8 v' ]& I0 Y8 y5 V* k
(1)激素处理小鼠,同期发情和超数排卵$ [* k4 @" o8 f. T+ s
(2)2:1合笼过夜(雌:雄)
: w$ R; z4 N* m$ _5 y; v (3)取出有阴道栓(即乳白色或淡黄色冻胶状物,确定其已经怀孕)的开始记时间为0.5天 4 }1 x6 R0 w/ X# w3 v' b1 a
(4)取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料
% M4 I' X, S* R; H (5)颈椎脱臼法处死孕小鼠,放于盛有75%酒精的烧杯中消毒,拿到超净工作台上解剖,先剖开腹部皮肤,暴露子宫,然后换另外一套手术器械,用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角,取出子宫,置于装有PBS的培养皿中。7 Q/ ~/ P1 r3 p x& Z
(6)取出胎鼠,在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢,仅留躯干部。在PBS中充分漂洗,弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)(若是想培养神经干细胞,则用剪刀剪取前脑进行培养即可)(可以一起处理多个胚胎); G( s% Z }. \2 y
(7)在新的培养皿中加入少量PBS,放入躯干部分,用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片(可以剪的更碎一点,下步的消化时间就可以缩短)。9 C2 M+ L8 W; C$ R I" s
(8)加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶,培养箱中消化10—15min,消化结束后加入等体积(多加点也行,只要不是少加,保证彻底的终止消化反应)的MEF Medium终止消化反应,轻轻吹打,使细胞分散。(做原代消化的时间稍长,胰酶用量也大,若是做传代,则只需加入500微升,最多1ml的胰酶,消化1~3min。)(躯干组织不易消化,做原代和传代时,故都用0.25%胰蛋白酶;而脑组织较易消化(脑肿瘤组织),原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。)(消化可能不完全,也可室温静置5-10min,弃组织块,这样下面过滤就相对容易。)(如果消化得到的细胞太少,可以离心弃上清,PBS洗涤,重新加胰酶消化)(胰蛋白酶,Trypsin ,最适条件pH8.0,37度,溶液中钙镁离子和血清会降低其活力,故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应) ) z3 G( P% T: u' X) ^" _2 W
( 9)将收集的细胞悬液离心,1500rpm, 4min,弃上清,加入红细胞裂解液(3~5倍体积的细胞体积),轻轻吹打1min,离心除上清,若仍有红细胞残留,则须继续进行红细胞裂解步骤。8 _. e3 P& ]$ \! C3 v
(10)离心,弃上清,重悬细胞,过滤(200目筛网)并收集滤液,离心除去上清。# I& s7 [! C' ~0 k
(11)用MEF Medium洗涤沉淀,离心除上清,重悬细胞,铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。(一只老鼠会有多个胚胎,得到的单细胞,可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养)
* N* y, V6 k% t4 b8 ~, @(12)第二天换液,随后每2天换液一次。培养2~4d后,MEF接近汇合,即可按1:3比例传代培养。
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要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。
0 V0 f% P" E4 f; N$ o7 o4 j. ]要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。
& i; Z0 I- o3 A0 K2.MEF传代(本步骤已经进行实践)
/ s8 {5 i# K% w% ^& _5 E5 S" l; z6 ~(1)消化:吸去培养皿中的MEF Medium,用PBS洗涤1次(加5ml)后,加入1ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化1min(时间可以浮动,视消化效果定,在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时,即可终止反应)。
: ]. k/ J. `9 [0 B5 \7 T7 g(注:加PBS洗涤,是为了除去血清,否则胰酶发挥不了作用)
1 I+ I4 T* g$ f/ ~(2)终止消化:加入5ml MEF Media终止消化(此时总体积为6ml),用吸管冲洗培养面并反复吹吸,使细胞离散成为单细胞悬液。(离心步骤省略:将细胞悬液移入离心管,1500rpm×4min。弃去上清液,用MEF Media重悬MEF成单细胞悬液。)" f D0 b- q. u9 _% N0 M
(3)分装接种:吸取2ml细胞悬液到新的培养皿中(其中已经加了8ml培养基),再取2ml单细胞悬液加到另外一个新的培养皿中(其中已经加了8ml培养基),此时原来的培养皿中还剩余2ml,吸取8ml培养基加入其中,轻摇,37度5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。(1传3,其中2个是新的培养皿,1个是旧的(原先的),多省啊! 100mm的培养皿,通常加10ml培养基)% `& g! k) K5 J; F Y0 L
(4)隔一天,视生长状况传代。: M3 U$ c% o+ y; [" I
' Z, G/ x4 j/ k0 `8 r: y4 g注意: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液., G+ V3 S: N6 { t. B1 o
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) y' O0 _; i& \& Q' A1 S% a& x* x3.冻存MEF(本步骤已经进行实践)
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在P2传P3代时,取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作,另外三分之二进行冻存处理(本实验中P2有27个dishes,其中8个继续做传代,成24个dishes;另外19个做冻存处理,每个dish冻存一管)。
$ R% S3 N8 x& m- p8 A(1)取出19 dishes,吸弃media,加PBS洗一次(5ml)。5 c0 @$ @3 P: k) v" r3 O
(2)加1ml trypsin下消化1分钟,加2ml media 终止消化,轻轻吹打下细胞并分散均匀,收集细胞悬液到15ml离心管中(本次三个dishes收集到一个15ml离心管中),再加1mlPBS冲洗dish,并转移到离心管中。
. y' F/ S& ^7 [(3)封口膜封口,放在离心机里,1500rpm,4度,4min,离心。与此同时,配制冻存液。取出DMSO(二甲基亚砜,作冻存剂。本实验室的DMSO是常温下保存在抽屉里的。瓶子是深色的。),喷撒酒精消毒,放在实验台上。取两支15ml的离心管,每管加9mlmedia,然后每管再加1ml DMSO,混匀。
% B9 H) a8 d+ H+ x% S5 T" ~(4)取出离心机里的离心管,喷撒酒精消毒,放在实验台上。取一管,倾倒去上清,加入3ml冻存液(因为要分装到3个冻存管中。冻存管总容量是2ml,最大刻度是1.8,本实验室通常加1ml冻存液进行保存),轻轻吹打几下,混匀细胞。取1ml,加入到冻存管中,放入冻存盒里(使用的是异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温,直接从室温放进-80可以达到近似于1度/分钟。异丙醇冻存盒在用之前要室温放置一段时间,让其达到室温后再用)。然后再对下一管进行操作。(应尽量避免细胞在常温下与DMSO的接触时间)
% M% c' B/ o$ F% S |' N+ @(5)把冻存盒放在-80度冰箱里过夜,第二天拿到液氮中冻存。(由于液氮罐已满,所以保存暂时保存在-80度冰箱里)
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/ D5 t- ?0 D5 t) b( i) T 问题:一dishes太多,在消化操作时一定要快,否则第一个dish可能消化时间较长,影响细胞状态。
$ F0 w: a- T+ Z; U+ _ 二加1ml PBS收取余下细胞时会,由于量太少易产生很多气泡,下次要增加量到2ml 。
4 }5 r5 x0 e, ?/ q9 Z 三冻存液使用的是MEF media + 10%DMSO,这样FBS含量少,对细胞状态产生影响,下次要增加FBS的含量(适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率)。(MEF media由DMEM 11965 +10%FBS+1%P/S)
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4. mitomycin C处理MEF,并冻存(本步骤已经通过实践)# y5 `0 k7 K; G% `" _$ y% h
(1)当P3代MEF生长接近汇合时,吸去原培养基,用PBS洗2次(每次5ml),然后加入4ml 10μg/ml的mitomycin C处理MEF细胞,置于培养箱内2h。( K+ R, w, J% E# K) ^; [
(2)弃去mitomycin C,用PBS洗涤2次(每次5ml)。9 v( ]1 ^% j9 I+ B+ Q
(3)加0.25%Trypsin 1ml消化1-3分钟,用2 ml MEF Media终止反应。轻轻吹打下细胞,并把悬液转移到15ml离心管中,用2ml PBS 洗涤,收集余下的细胞。(两个dishes的细胞转移至一个离心管中,总体积为5ml*2), Y4 Z: Q/ u2 p5 b- D) O8 c7 h) n
(4)1500rpm, 4度,4min,离心。与此同时配制冻存液(20ml MEF media + 2.5ml FBS + 2.5ml DMSO)。(此处相对3中冻存液,提高了FBS的含量,以期维持更好的细胞状态)
1 _# W! P5 t' W( A2 V! O(5)倾倒去上清,加2ml 冻存液重悬,分装到2个冻存管中,每管1 ml。标注信息。置于异丙醇冷冻盒中,放入-80度冰箱中过夜,第二天转移到液氮罐中保存。
7 P0 H, D0 y+ ^; m( l$ d) y" m# q" T) W8 e- F% f$ c9 O* v, e7 D
注:上面用的mytomicin C 可以用MEF media (DMEM应该以可以吧)配制,也可以用无菌的PBS配制。(Mytomicin C是针剂瓶装的,10mg/支,可以采用无菌PBS溶解,配制成1mg/ml,装在15ml离心管中,锡纸包裹(需要避光),4度保存即可。用时再配制成工作浓度;若是用MEF media配制,可以直接配制成工作浓度,用时直接取用。最好买sigma的。)注意丝裂霉素C 的有效期和使用方法。若发现分装的丝裂霉素C 溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素C已经失效, 不能再使用。
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/ D1 f) A, [; y) P# j0 _$ g5.复苏(本步骤已经通过实践)
0 f& H& v+ P7 ? i5 f0 r% T(1)取出冻存管,在37度水浴中迅速融化(1-2min),当有少量冰块剩余时取出,用吸水纸拭干水,用75%酒精喷一下。(剩少量冰块与完全融化,效果差别不大。也可完全融化)1 a" x- C) D0 }, G+ k* ~
(2)用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEF Media的15ml离心管中1000转,4度,4min,离心。
* ^8 I! }" f' X5 C, J4 N(3)2ml MEF Media 重悬,转移至加有8ml MEF Media的100mm培养皿中,于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 |
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