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作者：孟浩，罗卓荆，冯林杰，王亮作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所， 710032
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& p" Q8 C% N$ i" ` 【摘要】 ［目的］研制出一种可用于修复周围神经缺损的组织工程支架材料，并观察体外培养的骨髓基质干细胞在支架材料中的生长情况。［方法］以I型胶原蛋白和明胶通过冷冻干燥技术制备胶原蛋白支架材料。扫描电镜观察内部结构的排列规律及走行，测量其孔径大小、孔隙率等指标。将骨髓基质干细胞复合到胶原蛋白支架材料中共培养5 d后，扫描电镜下观察其在材料内部的生长情况。［结果］构建的材料均为圆柱状，内部为孔径均匀且平行排列的微管结构，体外培养的骨髓基质干细胞成功种植在支架材料上，在材料内部生长良好。［结论］构建的支架材料具有良好的三维空间构形和生物相容性，为神经损伤的修复提供了一种新型的支架材料。
1 _* Z7 H/ [% N9 T$ D 【关键词】组织工程; 胶原； 明胶； 骨髓基质干细胞
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周围神经缺损的修复一直是神经科学的一大难题，自体神经移植是临床上修复神经缺损常用的方法，但是，由于其存在增加一次手术、造成供区神经功能丧失、供受区神经不匹配等不足，应用受到了限制。人们用导管修复神经缺损已经有100多年的历史，近年来组织工程的发展为神经缺损的修复提供了可能，作者以胶原蛋白为主要原料制备了具有轴向微管结构的组织工程支架材料［1］，并将其与骨髓基质干细胞(BMSCs)复合，观察支架材料的生物相容性。8 G: d/ Y8 t4 N2 M* w) |5 @
: O( Q/ F7 M F; x/ Z9 R. x 1材料与方法! @0 R* t9 E2 [7 Q1 u
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1.1胶原蛋白支架材料的制备- I7 I/ {8 s" E! B \+ ^
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/ D1 Y! C$ W6 Y3 H/ {6 O6 {. S) | 分别称取I型胶原蛋白(Sigma C9879)150 mg，明胶(Sigma G9382)75 mg，溶于0.05 mol/L醋酸溶液中，在恒温4℃条件下，18 000 r／min搅拌90 min，负压抽真空后，4℃冰箱过夜，充分混合成凝胶状悬浊液，将悬浊液注入内径3 mm，长10 cm的硅胶管中，密封两端，顺轴向用自制微型调速仪以210-5 m／s的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40℃，100 mtorr条件中冻干48 h，即可制得干燥成形的胶原蛋白支架材料［2］。支架材料用戊二醛交联，CO60消毒密封备用［3］。
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1.2支架材料内部扫描电镜观察
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将上述方法制备的支架材料喷金镀膜，以扫描电镜观察其横截面、纵截面及材料外表面，并测量材料微孔的直径。
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0 ]- o, J! Y) l 1.3支架材料孔隙率的测量' O9 W. h" P3 u6 `- w
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: I9 L/ k5 P- [( f/ U9 M 把已知重量W1，体积V０的材料浸入装有水的密闭容器中，采用负压抽吸的方法排除材料孔隙内的空气，此时材料内部充满水，将材料取出，吸干表面的液体，称重为W2。W2-W１／1(水的比重为1)，得V１即为材料的孔隙体积，V1／V0即可得出材料的孔隙率。" V! T5 e6 S8 H7 X" `/ g6 a
5 }: `* c- L4 E$ {$ n 1.4骨髓基质干细胞的分离、培养- @0 m0 q2 q* r' e
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断颈处死SD大鼠，取双侧股骨，暴露出骨髓腔，培养液冲洗骨髓腔2～3次，将所获的冲洗液过滤，然后加入相同体积的0.84％NH4CL溶液［4］。850 r/min离心10 min后弃去上清，培养液(DMEM／F12 15％FCS)稀释后制成单细胞悬液，接种于培养瓶内，于37℃、5％CＯ2的培养箱中培养，72 h后换液除去未贴壁细胞，以后每周换液3次，当细胞生长达85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代培养［5］。7 m8 j3 W. |- y( x4 X- D
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1.5骨髓基质干细胞与支架材料的复合3 R# t6 H8 `, i% T, M! Q
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/ N, w3 C. q# V) y& q, ~. L* G* L 将培养的BMSCs胰酶消化后，制成单细胞悬液，将BMSCs悬液以110６／ml的密度用微量注射器分别注入10根4 cm的支架材料内，然后将材料置于骨髓基质干细胞培养基中培养，隔天换液，共培养5 d后，将支架材料取出，固定、干燥、喷金镀膜，扫描电镜下观察细胞在支架材料内的生长情况。1 m" J: R1 `* J$ B9 W8 K2 e
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2结果
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/ c3 u0 C0 Y9 w' n4 W( Y0 ~; _ 2.1支架材料的构建6 B$ `, r$ u# [6 M
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8 d& O- P5 ^1 ] _4 H- ^: z/ C 作者通过冷冻干燥技术制备了新型的周围神经组织工程支架材料(图1)，可以根据需要，制备成不同的外形和长度，作者所制备的桥接材料均为圆柱状；经物镜及电镜观察外表面为封闭结构，扫描电镜观察横切面显示微管内径较均一(图2)，其内部为轴向平行排列的微管结构(图3)，孔径在20μm～80 μm，与坐骨神经结构相似，从而为神经纤维再生提供了通道。作者随机选取20根已称重W１的材料，测量其截面直径、长度，计算出体积V0，按照上述方法称重W2，通过公式计算出孔隙率为81.5％。; m" k2 O+ ?1 o
. @% {0 u' C/ a- q* I% x& } 2.2BMSCs的分离、培养
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BMSCs接种后48 h开始贴壁伸展生长，大多数呈梭形，可见细胞团落形成，初次换液后，细胞迅速增殖生长，当细胞生长达到85％融合时，传代接种培养，通过传代换液除去未贴壁细胞来纯化BMSCs。当传至第3代时，BMSCs形态较一致，呈梭形生长，折光性较强(图4)。; i+ a# d$ t+ R$ s9 ^$ u; q, {
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2.3扫描电镜观察结果+ q( [0 v/ B! [- H( L5 ], c
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BMSCs注入支架材料并共培养5 d后，见有大量的BMSCs在支架材料内部贴附，细胞突起整合于支架材料内壁，且生长良好(图5、6)。
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3讨论
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( C2 W. q: @: y( Z& X0 k0 b 近年来，应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的支架材料修复外周神经损伤成为研究的热点。应用神经修复导管桥接两神经断端，引导神经轴突轴向生长，避免外生和形成神经瘤，为神经再生提供一个相对隔绝的微环境，可修复周围神经节段的缺损。目前神经组织工程支架材料主要分为天然材料(血管，胶原等)和合成材料(PLA、PGA等)，PLA、PGA在降解过程中降低了pH值，而pH值的降低可加速材料的自身催化降解，结果在材料周围将形成一个强酸环境，严重影响了细胞的功能，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向，胶原蛋白和明胶是细胞外基质的主要成分，胶原蛋白不仅对细胞具有趋化作用，而且还具有促进细胞黏附、增殖，无免疫原性，降解产物对细胞无毒性等优点。并可参与组织愈合过程，在烧伤创面敷料、组织再生诱导方面得到广泛应用，应用在神经导管中能刺激改善周围神经的再生［6］。作者以I型胶原和明胶为主要原料，通过冷冻干燥技术制备了具有轴向微管排列结构的神经支架材料，微管直径在20～80 μm，使其不仅在组成成份上，更在三维结构上高度仿生神经。这种轴向排列的微管结构，有利于引导再生轴突定向生长，材料的外表面为致密结构，可有效阻止体内纤维结缔组织的长入。有研究报道，BMSCs在周围神经损伤的修复中能够有效的促进轴突的再生［７］，本实验表明，BMSCs种植在支架材料并共培养后，有大量的细胞在支架材料内部黏附，生长良好，发出的伪足长入支架材料内，支架材料具有良好的生物相容性。综上所述，作者制备的胶原蛋白支架材料，为周围神经损伤的修复开辟了一条新的途径，具有良好的应用前景。 m% z/ O3 e/ V5 N0 y
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0 Z; V4 V4 [ Y, W5 v (本文附图见加页3)（略）
- A- R' r# `1 r! C$ s* |& E 【参考文献】0 |; H; F3 Z! Y8 @" u9 Q7 ~9 f
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发表于 2015-5-22 17:54
