髓核内注射骨髓间质干细胞对椎间盘基质的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:28 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张银刚，郭雄，李天清，王世捷，李曙明，许鹏，任峰玲作者单位：西安交通大学医学院：1. 第一附属医院骨科；2. 环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安  710061 $ R& |/ ?/ {7 K

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      【摘要】  目的  研究髓核内注射骨髓间质干细胞对椎间盘基质的影响。方法  32只新西兰大白兔，L2-3、L3-4、L4-5、L5-6被随机分为正常对照组、生理盐水对照组、细胞移植组Ⅰ、细胞移植组Ⅱ(BMP2转基因组)。髓核内注射后1、3、6月时间点，用Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组化染色分析胶原表型的改变，用实时荧光定量PCR分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达，采用重复测量方差分析进行统计学分析。结果  术后1、3、6月时间点，细胞移植组髓核有较多的细胞，蛋白多糖染色显示细胞移植组髓核兰染增加，免疫组化显示Ⅰ型胶原实验各组未见明显差异，Ⅱ型胶原细胞移植组有较强的红染颗粒沉积。实时荧光定量RTPCR分析显示，在细胞移植组，蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA增加，而Ⅰ型胶原mRNA则无改变。与细胞移植组Ⅰ比较，细胞移植组Ⅱ蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA增加。结论  骨髓间质干细胞移植能够提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，复合BMP2转基因有“分子增强效应”，提示基于骨髓间质干细胞移植策略是治疗椎间盘退变潜在的有效方法。
      【关键词】骨髓间质干细胞；椎间盘；基因治疗- a- h" O% q1 K0 f; c
   基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30400163)

　　The effect of injecting bone mesenchymal stem cellsinto nucleus pulposus on the biochemistry of intervertebral disc& N" Q* A' ]! b+ S* w2 `

　　Zhang Yingang, Guo Xiong, Li Tianqing, Wang Shijie, Li Shuming, Xu Peng, Ren Fengling9 W" ^; u% v2 n9 v1 k# h- Y

　　1. Department of Orthopaedics of the First Affiliated Hospital;5 K% z, ]' E4 A" N3 e1 z
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　　2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Disease of Education Ministry, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China
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　　ABSTRACT: ObjectiveTo explore the effect of injecting bone mesenchymal stem cells into nucleus pulposus on the biochemistry of intervertebral disc. MethodsTotally 32 rabbits were used, each of whose lumbar discs from the second to fifth were randomly divided into normal group, saline group, cell transplantation group Ⅰ, and cell transplantation group Ⅱ (group of the transferring gene coding BMP). At 1 month, 3 month, 6 monthtime point after operation, immunohistochemistry was used to determine the change of phenotype of collagen, real time PCR was used to analyze the expression of collagen type Ⅰ andⅡ and proteoglycan, followed by repeated ANOVA used to analyze the data. ResultsAt 1 month, 3 month, 6 monthtime point after operation, there were more cells in cell transplantation group than in normal group or saline group. Toludine blue staining showed that there was deeper blue in cell transplantation group than in normal group or saline group. Immunohistochemistry showed there was deeper red in cell transplantation group than in normal group or saline group in collagen type Ⅱ, whereas there was no change in collagen Ⅰ among the groups. Real time PCR showed that the expression of proteoglycan or collagen type Ⅱ was increased in cell transplantation group whereas collagen typeⅠ remained unchanged among the groups. In addition, compared to that of cell transplantation group Ⅰ, the expression of proteoglycan or collagen type Ⅱ was increased in cell transplantation group Ⅱ. ConclusionThe transplanted bone mesenchymal stem cells can increase the amount of proteoglycan or collagen type Ⅱ; combined with the transfer of BMP2, the effect is overlaying, suggesting that the therapeutic strategy based on bone mesenchymal stem cells may be effective in prevention and treatment of intervertebral disc degeneration.) g* c4 b( m/ ^% @
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　　KEY WORDS: bone mesenchymal stem cell; intervertebral disc; gene therapy3 U6 L5 t- N0 m% s3 {
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　　研究表明椎间盘退变起自于髓核，由于蛋白多糖含量的进行性丢失致髓核水分丢失。通过补充髓核内细胞数量和蛋白多糖成分，可增加髓核内蛋白多糖的含量，从而有较高的膨胀张力来保持椎间盘的高度和增加椎间盘分散负荷的能力，这些有助于停止或延缓椎间盘退变的进程[1]。已证实细胞因子、基因治疗、细胞移植能够停止或延缓椎间盘退变的过程[2]。骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)有多分化功能，体内外研究已证实可以分化为间充质细胞系，包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肝干细胞、肌肉细胞、心肌细胞。对于骨和软骨缺损，骨髓间质干细胞移植是一种便利和有效的方法[34]。在前期实验中，已证实异体的BMSCs能够在髓核内存活、增殖、迁移，外源基因能够在髓核内表达[5]。但BMSCs移植对椎间盘的退变及基质的影响，相关研究较少。因此，本研究将评估移植的BMSCs及复合BMP2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)的转基因治疗对髓核细胞外基质的影响。. v5 M7 l& j8 ^) n: |( e6 Z
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　　1材料与方法: _/ `4 p9 Q- `6 B( b" v/ o
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　　1.1主要试剂

　　Ⅰ型胶原鼠单克隆抗体购自美国SantaCruz公司，Ⅱ型胶原鼠单克隆抗体由德国ErlangenNumberg大学分子生物学实验中心惠赠，碱性磷酸酶生物素标记的抗鼠IgG购自华美生物有限公司，透明质酸酶、链酶蛋白酶、蛋白水解酶3hydroxy2naphthylocid 2,4dimethylaniline、Fast red购自美国Sigma公司，DNA Master SYBR Green I试剂盒购自美国RocheMdecular Bicchemicals公司，RNA提取试剂盒购自ISOGEN公司；含BMP2的BMSCs获得及培养参见文献[68]。
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　　1.2实验动物与分组8 u! }4 F* R5 J' k1 p
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　　取32只新西兰大白兔(由西安交通大学实验动物中心提供，年龄5-6年，体重4-5kg)，麻醉后使用侧方入路暴露椎间盘。实验采取随机区组设计，同一只兔子的不同椎间盘作为一个区组。每只兔中，L2-3、L3-4、L4-5、L5-6被随机分为四组作髓核注射：正常对照组(不注射)、生理盐水对照组(注射20μL生理盐水)、细胞移植组Ⅰ(20μL林格氏液包含1105的BMSCs)、细胞移植组Ⅱ(20μL林格氏液包含1105的含BMP2的BMSCs)。

使用专用微型加压注射器作髓核注射，缓慢自动推注。针定位依靠组织的抵抗力确定，在穿越组织时突感抵抗力消失有落空感后即停止，此时注射针已穿破纤维环进入髓核。对于练习者，髓核内的定位验证可通过推入液体有抵抗力而确认。实验前培训实验者，在新西兰大白兔标本反复操作，达完全熟练。0 `/ t8 ^* D5 F& x$ t# _6 E
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动物注射后，常规关闭伤口。术后，放入动物房，自由饮食。术后1、3、6月取材。实验中，8只兔子(在3个时间点分别为2、3、3只)用于组织学及免疫组化分析， 24只用于RTPCR分析蛋白多糖及Ⅰ、Ⅱ型胶原基质基因的表达。4 z/ \3 Q0 O0 |$ I0 ?/ u0 w. p+ y

　　1.3组织形态学观察% N% k1 ]0 r" _. O

　　所取椎间盘组织，经40g/L多聚甲醛固定，80g/L的中性EDTA脱钙液脱钙40d，常规石蜡包埋，用90g/L的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，厚6-8μm，伊红苏木素染色。

　　1.4蛋白多糖染色3 w/ J/ _' r+ v2 l5 m% p8 f
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　　软骨蛋白多糖用1g/L甲苯胺蓝染色。& X) ]3 y8 p5 F4 y: r7 H

　　1.5Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组化染色 % C. h( T$ ^5 T( c# X
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　　椎间盘Ⅱ和Ⅰ型胶原用单克隆抗体免疫组织化学染色测定。椎间盘组织石蜡切片用二甲苯脱蜡、逐级乙醇水化后，用透明质酸酶(Hyaluronidase 2g/L)室温孵育30min。Ⅱ型胶原用链霉蛋白酶(Pronase 1g/L)，Ⅰ型胶原用蛋白酶(Protease 0.02g/L)室温处理30min，加入一抗在4℃孵育过夜, 用碱性磷酸酶生物素标记的第二抗体孵育30min。用3hydroxy2naphtylocid 2,4dimethylanilid在室温下进行呈色反应。细胞核用苏木素复染, 用水溶性封片剂封固观察。阳性染色为基质和细胞周围出现红染颗粒。
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　　1.6实时荧光定量RTPCR" J5 W. X# s9 T+ U, W
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　　髓核组织取材后放入液氮快速冷冻后，使用研钵研磨。RNA提取应用异硫氰酸盐酚氯仿法，用硅胶旋转柱纯化RNA，放入-80℃保存。通过光吸收法测量RNA的纯度，每个椎间盘大约4-5μg RNA。使用RTPCR试剂盒，细胞RNA逆转录为cDNA并通过PCR扩增特定的基因。Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖引物通过Primer 5.0软件设计，引物由上海基因公司合成。上游和下游引物序列及片断大小见表1。定量PCR采用DNA Master SYBR Green I反应系统，20μL PCR反应体系，在实时荧光定量PCR仪中反应。反应条件为：GADPH：95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延长12s。温度转化速率20℃/s，循环数35；其余视基因不同，参数有所变化。融化曲线通过20℃/s的转换速率将温度降至60℃后，0.1℃/s的速率将温度升至95℃，检测每一步的荧光强度。正常对照组1月的平均值认定为100%，其余值与对照组比较换算为相对值。表1实时荧光定量PCR分析髓核基质基因及内对照的引物（略）  H. C2 Q5 Y$ i# _4 Q

　　1.7统计学分析

　　对于RTPCR分析所得值，采用重复测量方差分析进行统计学分析，P

　　2结果

所有新西兰大白兔顺利完成手术并康复。取材后，肉眼观察未见各组椎间盘出现异常情况。! i: @. Q& |* ?7 H: c/ Z
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　　2.1组织形态学的变化

　　椎间盘HE染色(图1)发现细胞移植组Ⅰ、Ⅱ髓核有较多的细胞。在1、3、6月时间点，各组纤维环排列尚规则，髓核无纤维化、裂隙，髓核内没有观察到血管化、炎症细胞浸润，无椎间盘退变的明显征象，但在细胞移植组Ⅰ、Ⅱ髓核内有较多的细胞。. T" r+ W+ B* b  H. b( P- D1 j  y
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　　2.2蛋白多糖染色结果/ X& S( @& A4 K# J2 Z

　　蛋白多糖染色(图2)显示在椎间盘的髓核及部分纤维环出现兰染，在1、3、6月各个时间点，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ比正常对照组兰染增加，而生理盐水组和正常对照组相比无明显改变，细胞移植组Ⅱ与细胞移植组Ⅰ相比无明显改变。在细胞移植组，同组内3个时间点比较，6月点的兰染最深，3月次之。

　　2.3免疫组化染色Ⅰ、Ⅱ型胶原表型表达的比较7 A4 e1 Q0 J0 K% U8 ?  o
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　　Ⅰ型胶原单克隆免疫组化染色显示椎间盘的纤维环出现红染颗粒，并波及髓核外部，髓核内部未见红染颗粒。各组无明显差异。

Ⅱ型胶原单克隆免疫组化染色(图3)显示红染颗粒主要出现在椎间盘的髓核及内侧纤维环，以内侧纤维环红染最强。在各个时间点，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ比正常对照组红染，而生理盐水组和正常对照组相比无明显改变。在细胞移植组，同组内3个时间点比较，6月点的红染最深，3月次之。; O: g9 v% ^9 q: o
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　　2.4RTPCR分析基质基因的mRNA的改变6 A( `" r7 T3 F$ U

　　在3组间，RTPCR分析值显示了统计学的差异(P=0.006)，但时间和兔个体(区组)作为因素分析无差异。组间比较显示，在细胞移植组Ⅰ和细胞移植组Ⅱ，蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达增加，而Ⅰ型胶原表达则无改变(表2)。表2实验各组的基质基因RTPCR分析的结果（略）# ^8 ]' u$ h3 L/ V
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RTPCR结果显示，在1、3、6月各个时间点，与正常对照组比较，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ的蛋白多糖增加，而生理盐水组无差异。在同时间点(1、3、6月)，细胞移植组Ⅱ蛋白多糖的表达高于细胞移植组Ⅰ。在同组内不同时间点比较，各组无统计学差异。Ⅰ型胶原的表达，在1、3、6月时间点组内及3组间无统计学差异。Ⅱ型胶原的表达，在1、3、6月时间点，与正常对照组比较，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ的表达增加。而且，细胞移植组Ⅱ高于细胞移植组Ⅰ。在同组内不同时间点比较，各组无统计学差异。$ j% F  H* Y5 m& x9 M
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　　3讨论
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很多研究集中于椎间盘退变的生物治疗，包括生长因子、细胞移植、基因治疗。对于椎间盘退变的早期或早中期，药物治疗[9]、生长因子和基因治疗可能是有效的；对于晚期或严重椎间盘退变时，椎间盘细胞已失去活力，对生物性刺激已无反应或较低。在髓核切除术后，重新构建髓核，仍需要正常的细胞或基因修饰的细胞。在细胞移植和转染治疗时应用髓核细胞(自体和异体)和软骨终板的软骨样细胞。但是，这些细胞不易采集、培养和扩增。而BMSCs容易采集、培养和扩增，便于临床应用。考虑到移植的BMSCs的功效可能是微小的，作者没有采用椎间盘退变的“人为”模型，而是采用老龄椎间盘退变的模型。这是因为，一方面动物模型本身存在的较大差异不利于评价移植细胞的功效；二是因为老龄椎间盘自然的变化是椎间盘退变的主要原因。( V5 S/ _8 r. z# Z
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本实验显示移植的BMSCs能够提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，推测这种结果可能和BMSCs的可塑性有关[10]。体内外实验证实，BMSCs能够分化为心肌细胞、神经元细胞、肌肉细胞、肝细胞和上皮细胞等多种胚层的细胞。BMSCs的分化主要受微环境支配，如将短Ⅰ型胶原的转基因鼠的BMSCs注射入裸鼠中， RTPCR检测短Ⅰ型胶原仅在骨中表达，而不在软骨中表达[11]，而移植于软骨缺损处，由于低代谢和应力的刺激，BMSCs分化为软骨样细胞。同样，如果BMSCs移植于髓核内，由于髓核的低血供和特殊的应力环境，将可能向髓核样细胞分化。

Riew等[12]用BMP2转基因策略成功地骨性融合了椎间隙，但本实验结果并没有发现椎间盘骨化，推测可能是Riew等手术摘除了髓核，导致血管入侵，而本实验没有破坏椎间盘的完整结构，没有血管入侵，避免了BMSCs骨化的发生基础。含BMP2的BMSCs移植同样可以提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，且在同时间点，对蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的提高要优于BMSCs移植，可能是移植的含BMP2的BMSCs分泌的BMP2，一方面促进了自身向软骨细胞类分化，另一方面上调了髓核细胞表达基质的功能。这表明BMP2的转基因治疗有“分子增强效应”。/ _1 E, C3 A- v) S9 _) H# ~& [
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本实验显示，BMSCs移植能够提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，复合BMP2转基因有“分子增强效应”，提示基于BMSCs移植策略是治疗椎间盘退变潜在的有效方法。
      【参考文献】6 E& g  s9 Q# ^
　　[1]Roughley PJ, Alini M, Antoniou J. The role of proteoglycans in aging, degeneration and repair of the intervertebral disc [J]. Biochem Soc Trans, 2002, 30(Pt 6):869874.
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　　[3]张银刚，杨述华，罗怀灿，等. 胎兔骨髓骨祖细胞的培养和鉴定 [J]. 同济医科大学学报, 2000, 29(4):331333.

　　[4]张银刚，杨述华，罗怀灿，等. 胎兔骨髓间质细胞修复骨缺损的实验研究 [J]. 同济医科大学学报, 2000, 29(5):432433.: W* K( J$ d) @" X
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　　[5]王金堂，张宏，张银刚，等. 骨髓间质干细胞异位移植在椎间盘内的迁移及外源基因的表达 [J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(7):12631267.
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　　[7]张银刚，郭雄，师常宏，等. BMP2EGFP融合蛋白的构建及其生物活性 [J]. 中南大学学报(医学版), 2005, 30:1620.9 {% V8 R6 t) a$ G+ ^4 q

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