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发表于 2009-3-3 12:27 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王莹  龚卫琴  张珊红  侯志峰  宋武战  王跃民  李源作者单位：第四军医大学西京医院老年病科，陕西  西安  710032 " w' j8 o/ E: O* b
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      【摘要】  目的  评价尾静脉和心肌内注射两种途径将骨髓间充质干细胞（MSCs）植入梗死心肌的有效性。方法  结扎左冠状动脉前降支制备心梗模型。同种异体SD大鼠MSCs体外分离、纯化、扩增，4，6二脒2苯基吲哚（4,6diamidino2phenylindole，DAPI）标记，MI后2 w将MSCs以尾静脉和心肌内注射途径植入大鼠体内，植入4 w后测定心功能，并行免疫组织化学检测。结果  细胞形态学及抗体测定显示MSCs分化为心肌样细胞，心功能评价试验组显著优于对照组组（P＜005），梗死面积直接心内注射组［(40±4)％］和经尾静脉移植组［(41±3)％］明显小于对照组组［(45±2)％］(P＜005)。结论 MSCs 静脉移植能够明显改善心功能和减小梗死面积，但是疗效稍逊于直接心内注射组。
      【关键词】骨髓间充质干细胞；心肌梗死；细胞移植


　　有资料显示终末期心功能不全的5 年死亡率仍大于50％〔1〕。传统的药物及介入治疗不能从根本上修复已坏死的心肌组织，细胞移植可以替代、修复或改善受损心肌的生物学功能是近年来心血管病研究领域的一大热点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的可塑性为心肌再生医学带来了希望〔2〕，大量研究已经证实干细胞移植可以提高心脏功能，缩小梗死面积。最新研究心梗后2 w〔3〕是细胞移植的最佳时机，但是合理有效的移植方式仍是值得讨论的问题。' a4 e  w7 B% s/ c/ K8 s: v

　　1材料与方法
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　　11动物取5只100～200 g清洁级封闭群标准SD雄性大鼠作为骨髓供体，另取8 w龄标准雄性SD大鼠30只（购于第四军医大学动物实验中心）制备心梗模型，随机分为尾静脉注射组、心肌内直接注射组，对照组，每组10只。
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　　12试剂与抗体低糖DMEM培养基（购于GIBCO公司）；胎牛血清FCS（购于杭州四季青公司）；aActin肌动蛋白，SABC免疫组化染色试剂盒和Cy3免疫组化显色试剂盒（均购于武汉博士德公司）。( s6 M5 v. W: ^" B6 o

　　13大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、扩增雄性SD大鼠脱颈处死后，无菌条件下分离下肢长骨，用含体积分数15% FCS的LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，得到的细胞悬液接种到培养瓶，置于37 ℃、50 ml/L CO2培养箱中，48 h后更换培养液，以后每2 d换液1次。待细胞覆盖到瓶底的80%时，用025%胰酶消化传代。( T3 n% {; s, V* ]/ e' I# @
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　　14移植前细胞标记收集3～6代大鼠MSCs，消化洗涤后，重悬细胞，加入无菌DAPI(50 mg／L，Sigma)，37 ℃孵育30 min，离心后PBS反复洗涤5次，以去除未结合的DAPI，离心收集细胞，无血清培养基重悬，置于冰浴中1 h内进行细胞移植〔4〕。$ b' @: i( w1 |# \& ?( d; u
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　　15大鼠心肌梗死模型的制备结扎左冠状动脉前降支建立心梗模型〔5〕。30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（15 ml/kg），气管插管，心电监护下，左胸第3～4肋间隙钝性分离软组织及肌肉层，连接呼吸机，呼吸机频率为60次／min，潮气量为3 ml／次。剪开胸膜，暴露心脏，于左心耳下方1～2 mm处用7／0号丝线穿扎左冠状动脉前降支，结扎后左室壁变苍白，心电监护可见R波振幅升高，ST段抬高，证明结扎成功。观察大鼠呼吸情况，平稳后拔除气管插管，放入动物笼喂养。' P6 ]3 k: \0 }( {% f4 S* m) h

　　16MSCs的移植心梗2 w后通过尾静脉和心肌内两种注射方式将DAPI标记的MSCs移植到实验大鼠体内。直接心内注射方法：在上次开胸的下一肋间做左胸横切口，小心钝性分离软组织及肌肉层，连呼吸机，仔细分离黏连组织暴露心脏，直视下用28号针将DAPI标记的MSCs注射到梗死边缘区，采用多点迷路注射，注射后旋转针尖，留针数秒钟，以防止细胞外渗，术后肌注青霉素预防感染，对照组组不予处理。
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　　17左心功能测定心梗后6 w再次麻醉大鼠，经右侧颈总动脉插入20 G左心导管至左心室，并与4道生理记录仪相连，连续记录各组大鼠左心室收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp／dtmax)。
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　　18心脏标本处理、MI面积测定及免疫组化鉴定完成心功能测定后，立即开胸，取出心脏，PBS液冲洗，去除左右心房和右心室,用10％甲醛固定，石蜡包埋,5只进行MI面积测定；余切10 μm厚的切片，在荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞的定位，相邻切片HE染色，其他连续切片进行αActin肌动蛋白染色鉴定。实验严格按照说明书进行操作。

　　19统计学处理所有数据 x±s 表示：多组比较采用单因素方差分析，SNKq法做均数多重比较，所有数据采用SPSS软件处理，检验水准设为005(双侧)。

　　2结果; h+ G9 t5 H% a3 ?6 X) U& q

　　21大鼠MSCs细胞的鉴定贴壁生长的MSCs呈细而小的长梭形或多边形，以集落方式增殖，到14 d达80％融合时消化传代再培养，以后每4～5 d就可传代一次，将这些细胞进行流式细胞术表面标记鉴定，细胞表面抗原CD34，CD45,CD31阴性,CD44弱阳性，CD90强阳性，细胞均一性较好。

　　22MI模型的建立和鉴定及MSCs细胞的标记情况心梗后6 w观察心脏大体标本，可见瘢痕形成，病理切片HE染色心肌纤维排列紊乱，核溶解，甚至心肌细胞消失，形成胶原纤维。MSCs细胞标记后在荧光显微镜下观察，约100％的细胞DAPI标记阳性（图1）。3 l7 p( X2 D' R7 V" G; \/ D! N
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　　图1DAPI在细胞中100%标记（略）: @- N' b4 {  g' B* f
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　　23骨髓MSCs在梗死心肌组织中的存活分化及免疫组织化学检测荧光显微镜观察发现，试验组织切片中DAPI标记阳性细胞在梗死心肌内广泛存活，呈椭圆形类似心肌细胞核，并与心肌纤维排列方向一致，沿心内膜下肌层有由疤痕周边注射部位向中心迁移定居，一些DAPI阳性细胞与宿主心肌相连，这些细胞胞浆丰富，而且同一视野下可以观察到，DAPI核染色阳性的细胞同时Actin染色也呈阳性，提示移植的骨髓干细胞在宿主心肌中表达αActin肌动蛋白。对照组中则无DAPI阳性标记的细胞（图2、图3）。- ]: R5 s; R' L
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　　图2心肌组织冰冻切片DAPI标记的细胞核蓝染（略）
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　　图3同一视野的Actin染色（红色）（略）. x: ~1 z; W, L2 r) W( g
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　　24左室血流动力学指标移植组左室心功能各指标都较对照组有明显差异（P＜005），静脉移植组左室收缩未压、左室最大上升速率均稍逊于直接心内注射组（表1）。$ n6 f2 G5 w' m% G

　　表1不同方式移植后左心室功能的比较（略）

　　与对照组比较：1）P＜005) m% U: [/ V. d* m2 w3 E
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　　25左室瘢痕面积百分比直接心内注射组〔(40±4)%〕和经尾静脉移植组〔(41±3)%〕瘢痕面积明显小于对照组〔(45±2)%〕(P＜005)，两实验组无明显差异。1 _7 u, X3 y* L. P
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　　3讨论, y# P& H$ f2 E" D4 x+ I

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　　心肌一旦发生梗死，血液供应急剧下降，侧支循环相继建立恢复部分血供，此时将骨髓间充质干细胞通过静脉途径注入患者体内，在梗死心肌的趋化用下，通过侧支循环到达梗死部位，改善心功能，缩小梗死面积。心梗患者大多为老年人，无法承受开胸手术，甚至有相当一部分患者无法接受介入治疗，这样就无法将干细胞通过心肌内或冠脉途径移植到患者体内，此时可以考虑静脉移植途径。我们的实验证实：心肌损伤后，心肌局部的损伤微环境对骨髓干细胞具有趋化及促分化的作用，通过静脉途径移植的干细胞可以通过侧支循环到达梗死部位，并分化为心肌样细胞。Orlic等〔6〕的研究结果也说明了通过静脉途径注入干细胞者与对照组比较能够较明显的改善左心室功能，缩小梗死面积。当然与心内直接注射相比，效果稍差，但是静脉途径创伤小，操作简单，易于进行，具有一定的临床应用价值，同时对于大范围小面积多灶性梗死静脉途径更为有效。静脉移植干细胞改善心功能的具体机制还不很清楚，可能的机制：一是MSCs在心脏微环境中发生分化，具有肌纤维的收缩性，与宿主心肌细胞形成偶联而同步收缩,增强了心肌的收缩力〔7〕；另一是MSCs与宿主组织相互作用可产生一系列细胞营养因子，有助于心功能的恢复；再者移植细胞通过肌纤维的弹性作用限制心室扩张和重构，改善心肌细胞收缩性〔8〕。Tomita等〔9〕认为局部移植时心功能改善的主要机制是移植细胞向心肌的分化和血管新生，而静脉移植改善心功能的机制可能有所不同，具体机制尚需进一步研究。* A: ?7 \/ \- D2 w4 K
      【参考文献】1 J0 n* u: Y" R) o
　　1  Kessler PD,Byme BJMyoblast cell grafting into heart muscle:cellular biology and potential applications〔J〕Annu Rev Physiol,1999；61:21942．1 U+ o3 S+ A' \  e# C& z

　　2  牛丽丽,曹  丰,郑  敏,等同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死〔J〕中华内科杂志,2004；43(3):18690．

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　　2  Niu LL,Cao F,Zheng M,et alTransplantation of exogenous mesenchymal stem cells for treatment of myocardial infarction in rat〔J〕Chin J Internal Med,2004；43(3):18690．
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　　3  曹  丰,贾国良,牛丽丽，等移植时机对骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的影响〔J〕第四军医大学校报，2005；26(1):2227

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　　4  Wang J,ShumTim D,Galipeau J,et al．Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty:Feasibility and potential clinical advantages〔J〕J Thorac Cardiovasc Surg,2000；120(5):9991006．
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　　5  高  峰,施东伟,王晓明，等极化液对缺血/再灌注大鼠心肌细胞死亡及心脏功能的影响：胰岛素的关键作用〔J〕中华内科杂志,2003；42(3):14852．; N3 v1 ^5 K4 W$ m& Z8 ^- {1 C

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　　6  Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,et alMobilized bone marrow cells repair the infarcted heart，improving function and survival〔J〕ProcNat Acad Sci USA,2001；98(18):103449．+ i- @5 M; i" k; \9 A/ M. B$ d

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　　7  Wang JS,Slum TD,Galipeau J,et alMarrow stromal cells for cellular cardiomyoplastu:feasibility and potential clinical advantages〔J〕J Thorac cadiovasc Surg,2001；120:9991005．. q. J% l& _8 `5 i. {$ b7 }

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　　8  Fukuda KDevelopment of regeneration cardiomyocytes from mesenchaymal stem cells for  cardiovascular tissue engineering〔J〕Artif Organs,2001；25（3）:18793

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　　9  Tomita S，Mickle DA,Weisel RD,et alImproved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation〔J〕J Thorac Cardiovasc Surg,2002；123:113240．

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