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作者：杨景全 路来金 闫峻 范东艳 崔建礼 邬伟作者单位：吉林大学第一医院手外科，吉林 长春130021
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% [ n; n" l+ U 【摘要】 目的 探讨大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经样细胞的作用。方法 分离得到的MSCs在体外扩增、传代。用碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后加入不同时间的臂丛神经损伤大鼠脊髓匀浆上清液诱导。免疫细胞化学染色检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达，以鉴定分化细胞的表型特征。结果 细胞诱导后具有神经元或胶质细胞样细胞的形态，相应细胞表面标志NSE或GFAP阳性，以损伤后7 d脊髓匀浆上清液诱导组NSE阳性和GFAP阳性率最高（P＜005）。结论 臂丛根性撕脱伤大鼠脊髓匀浆上清液在体外能够有效地诱导骨髓MSCs分化为神经样细胞，伤后1 w可以作为MSCs移植的最佳时间。 8 k, }& n/ U1 z8 M/ j: V
【关键词】骨髓间充质干细胞； 脊髓匀浆上清液；分化1 e: s! U" T7 I
近年的研究表明，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潜能和明显的可塑性，MSCs不仅具有向中胚层分化的能力，而且具有向内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞及神经细胞等分化〔1，2〕。Kopen等〔3〕将MSCs注入新生鼠的侧脑室后可分化为神经胶质细胞和神经元。这表明MSCs在接触神经系统的微环境时，可分化成相应的神经细胞。本实验用大鼠脊髓匀浆上清液对MSCs进行体外诱导分化来探讨MSCs在体内分化的可能影响因素，旨在为MSCs在神经系统损伤修复中的应用提供实验依据。$ l8 l s, r1 a0 M$ v5 o
- _+ ^9 `0 N8 b4 s2 Y0 o0 Q 1材料与方法+ A" \* Y% ?# n* K" _/ L
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11 动物
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健康Wistar大鼠(吉林大学实验动物中心)，8周龄，雌雄不限。
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12 主要试剂及仪器
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LDMEM培养基(Gibco)，NSE抗体及GFAP抗体(兔抗鼠，多抗)、SP即用型试剂盒、DAB底物显色试剂盒(福州迈新公司)，胎牛血清(中科院生物工程研究所)，胰蛋白酶(SIGMA)，倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)，CO2培养箱(日本SANYO)。
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13方法
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* m, @: X; X0 d" F1 { 131 大鼠MSCs的体外分离培养! F+ l# D5 S. D, A0 }5 w' h
j/ ]* U/ b# P$ P9 c- O+ a" n 取8周龄Wistar大鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出其股骨和胫骨，用DMEM冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，所得细胞悬液以 5106 ml-1的细胞密度接种于75 ml培养瓶中，在含20%胎牛血清LDMEM完全培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，2 d后首次换液，去除未贴壁细胞。以后每3～4 d换液1次，待贴壁细胞融合90%时，以025%胰蛋白酶消化、传代。每2～3 d传代1次，传至第4代时进行实验。. W6 z/ X2 | P+ l+ c
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132 大鼠脊髓匀浆上清液的制备
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健康Wistar大鼠，8周龄，体重220～250 g，按郑圣鼐等〔4〕报道的方法制作大鼠全臂丛根性撕脱伤模型。对正常和伤后0、7、30 d的大鼠，在10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉下取出C5～T1节段脊髓，立即用4℃ 001 mol/L的PBS液冲洗，并置于5 ml 4℃ 001 mol/L的PBS液中进行匀浆、离心(2 000 r/min，10 min)，取上清液用02 μm的针头滤器过滤，-20℃下冷冻保存备用。! T. \! O" r& A8 C
5 [6 v$ }$ X! T0 u# V, s 133大鼠脊髓匀浆上清液对MSCs的诱导分化" _: v; R; y" [
* l' w( l2 B; T1 t 取第4代MSCs以3105/ml密度接种至5板铺有盖玻片的24孔培养板，培养24 h后吸去完全培养液，用含10 ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)的LDMEM完全培养液预诱导24 h以促进分裂，然后用001 mol/L的PBS液洗涤3次，每孔加入含诱导剂的无血清培养液1 ml，以每板为一组按如下5组进行诱导:(1)对照组：每孔加入001 mol/L的PBS 100 μl；(2)正常脊髓匀浆上清液组:每孔加入正常脊髓匀浆上清液100 μl；(3)伤后0 d脊髓匀浆上清液组:每孔加入伤后0 d脊髓匀浆上清液100 μl；(4)伤后7 d脊髓匀浆上清液组:每孔加入伤后7 d脊髓匀浆上清液100 μl；(5)伤后30 d脊髓匀浆上清液组:每孔加入伤后30 d脊髓匀浆上清液100 μl。- x$ l# { j, }3 u* o
/ ~, c8 B$ |3 N 134免疫细胞化学分析
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覆有诱导细胞的盖玻片用001 mol/L PBS洗涤3次，后用10%中性甲醛固定30 min，PBS 洗涤，02% TritonX100作用10 min，过氧化物酶阻断，非免疫动物血清孵育10 min，加NSE、GFAP抗体，4℃过夜，加入生物素标记的第二抗体，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，DAB溶液显色，苏木素复染，中性树胶封固，在显微镜下观察。细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野(100)，计算NSE、GFAP阳性细胞分别占总细胞数的比例。
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. P* L. [$ m3 s! U 14 统计学方法. T( i0 ]1 N$ l: ]# h1 e$ z
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数据用SPSS110软件处理，实验数据以x±s表示，各组间比较用单因素方差分析及Tukey两两比较。
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; ?. h( `6 w7 l 2 结果
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! f, T- l+ G- p' a7 o 21大鼠MSCs的镜下观察7 |, }, W, E/ Z; M
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在原代细胞接种24 h后可见少数单核圆型细胞贴壁，72 h后见细胞大部分贴壁。5 d后细胞明显增多，开始呈集落生长，细胞主要有两种形态：一种为大的、扁平样的细胞，成不规则形态。另一种为成纤维样细胞，呈梭形。8～9 d增殖趋于平缓，10～11 d细胞铺满瓶底并融合。传代的MSCs开始呈圆形，贴壁迅速，重新延伸为梭形或扁平型细胞，当细胞传至3～4代后，已基本纯化为全梭形细胞，显微镜下观察呈鱼群状排列(见图1)。
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+ P( y- O' x) m1 k" `, j& X 22大鼠脊髓匀浆上清液诱导MSCs向神经样细胞分化
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) f4 t0 f' b4 k; a' T6 Q$ ^8 ^3 G2 j 实验组MSCs 用含10 ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)的LDMEM完全培养液预诱导24 h，细胞形态逐渐变成细长梭形，排列规则。24 h后各组再换入含相应脊髓匀浆上清液的无血清LDMEM培养液诱导1 w。细胞形态逐渐出现改变，胞体折光性强，细胞伸出长长的突起，并可见相互交织，类似神经细胞样。各实验组均有上述改变，但以伤后7 d脊髓匀浆上清液组最为明显。在诱导1 d后开始出现形态改变，以第4～5天最明显。对照组细胞形态则未见明显变化。& j( x$ _1 f! N+ I8 ]8 W8 c' ]
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23诱导细胞的鉴定) I1 L& j6 Y: }# X$ | s& r' _# E- L Y
- d6 V% f4 E3 t9 U9 R 采用神经元标志物NSE、神经胶质细胞标志物GFAP进行鉴定。结果显示，大鼠脊髓匀浆上清液诱导5 d后，部分细胞表现为NSE或GFAP染色阳性，呈棕褐色(见图2)。对照组则无阳性细胞出现。随机计数10个视野计算结果显示：正常脊髓、损伤后0、7、30 d脊髓匀浆上清液诱导出的NSE阳性细胞数分别为(234±36)%、(215±52)%、(307±49)%和(249±35)%，GFAP染色阳性细胞数分别为(159±41)%、(147±48)%、(208%±37)%和(165±34)%。经统计学分析，损伤后7 d脊髓匀浆上清液诱导组NSE阳性和GFAP染色阳性细胞数高于其他组（P＜005）。
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3讨论! {( ]. ~ t* I" G% O
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# U4 w! ]8 G( K, ^4 S P4 P& d/ e有研究〔1，3，5〕显示，MSCs不仅具有多向分化的潜能，而且有明显的可塑性，意味着MSCs的定向分化不一定只是单方向的，在合适环境下可以为多向分化。MSCs 在体内分化为何种细胞可能受着很多因素的影响，其所处微环境的改变、宿主对其的诱导趋化作用及其可能分泌的某些趋化因子、生长因子等可能是很重要的诱导因素。而转化的关键就是诱导分化的条件。5 D( U* y; G( o4 p2 z
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本实验结果显示:4种脊髓匀浆上清液均在诱导第4～5天出现了一定比例的神经样细胞。尤其以损伤后7 d脊髓匀浆上清液诱导组诱导的细胞分化率较高，生长状态良好，而且成活时间较长。诱导分化后的神经样细胞除部分表达神经元特异性标志NSE外，另有部分细胞表达星状胶质细胞标志物GFAP。说明细胞不仅是出现形态上的变化，而且在基因表达水平也发生改变。NSE是神经元表达的特异性蛋白质，而GFAP是星状胶质细胞的标志物。NSE和GFAP阳性结果表明，MSCs经脊髓匀浆上清液诱导后，不仅出现神经元样细胞的分化，也出现了神经胶质细胞的分化。Ankeny等〔6〕证实在将MSCs植入大鼠损伤脊髓中后有一定数量的细胞表达GFAP。这提示MSCs在一定环境下可以多向分化。脊髓匀浆上清液中可能包含着促使MSCs向不同细胞分化的诱导因子。本实验中损伤后7 d脊髓匀浆上清液组表现出较强的诱导作用， NSE阳性和GFAP染色阳性细胞数明显高于其他组(P＜005)。表明损伤后早期的局部微环境可能更有利于动员代偿反应机制，从而增强MSCs向神经元和神经胶质细胞方向分化的诱导作用。Hofstetter等〔7〕的实验证明，在脊髓损伤后1 w采用MSCs移植治疗比伤后立即进行治疗显著地提高了细胞存活数量并获得功能的明显改善。这些都为我们选择最佳的细胞移植时机提供了理论依据。本实验进一步证实了MSCs的多向分化潜能和可塑性，同时提示脊髓匀浆上清液可以在体外诱导MSCs分化为神经样细胞，为臂丛神经根性撕脱伤后选择细胞移植提供理论依据。而MSCs所处微环境的改变可能是影响其向何种细胞分化的重要因素，具体分化机制还有待进一步研究。) N- C- v% K7 ]9 E
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4 郑圣鼐，张高孟，顾玉东，等颈胸椎前路和后路制作大鼠臂丛神经根性撕脱伤模型探讨〔J〕中华显微外科杂志，2003；26(4):2912" k2 U9 \/ O% D- J! V6 w* `. S$ \
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发表于 2009-3-3 12:26
发表于 2015-5-26 12:10
