甲胎蛋白在肝癌细胞株的癌干细胞中的表达 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:25 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杜珍武  邸军  盛春华  王茜  金正贤  张玉成  张桂珍作者单位：吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林  长春  130033　1  吉林省人民医院病理科 0 Q3 z/ c6 z, j& ~3 N2 i. }
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      【摘要】  　　目的  观察甲胎蛋白在肝癌细胞株的癌干细胞表达。方法  利用肝癌细胞株HepG2,采用细胞克隆法分离肝癌干细胞，倒置显微镜下采用细胞克隆形态鉴别肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。应用免疫细胞化学技术对所用的细胞克隆进行AFP的检测，同时以宫颈癌细胞株HeLa作为阴性对照。结果  HepG2细胞形成三种克隆形态,即Holoclones型、Meroclones型、Paraclones型,其中Holoclones型为少数,是肿瘤干细胞。免疫细胞化学技术显示，HepG2细胞三种克隆AFP染色均为阳性，HeLa细胞AFP染色为阴性。结论  肝癌细胞株HepG2分离的癌干细胞表达AFP，为以AFP为靶点的肝癌肿瘤干细胞治疗提供了实验基础和理论依据。 - P, J6 ~! K5 q2 R
      【关键词】甲胎蛋白 HepG 2细胞肝癌干细胞$ |8 _5 V- u6 i1 H+ a% p, L: [& `
   　　The expression of alphafetoprotein in carcinoma stem cell of hepatoma carcinoma cell strain
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　　DU ZhenWu, DI Jun, SHENG ChunHua, et al.
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　　Central Laboratory, ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin, China

　　【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of alphafetoprotein (AFP) in stem cell hepatoma carcinoma cell strain.MethodsCarcinoma stem cells isolated by cell clone from hepatoma carcinoma cell strain were observed under inverted microscope to identify carcinoma stem cell and common cancer cells. AFP expressions in cell clone were detected by immunocytochemical technique, taking cervical cancer cell strain HeLa as negative control.ResultsHepG2 cells formed three kinds of clone shape, such as Holoclones, Meroclones, Paraclones type, as carcinoma stem cell Holoclones type cell was a few. Immunocytochemical technique showed AFP staining of HepG2 clone was positive, but that of HeLa cell was negative.ConclusionsThe expressed AFP in stem cell isolated form HepG2 could provide experimental basis and theory evidence for treating liver cancer taking AFP as target point.

　　【Key words】Alphafetoprotein (AFP)；HepG2 cell；Liver cancer stem cell0 v, @* \6 Z+ |8 Z

　　肿瘤干细胞是最近几年提出的关于肿瘤发生、发展机制的新理论，该理论认为肿瘤干细胞是肿瘤治疗的靶细胞〔1，2〕。甲胎蛋白（αFetoprotein，AFP）是肝癌的重要标志物之一，可利用其在肝癌细胞内表达的特异性进行针对AFP蛋白的肝癌疫苗或利用AFP基因的启动子与增强子进行肝癌的靶向特异性基因治疗〔3，4〕。根据肿瘤干细胞理论，以AFP为靶点进行肝癌治疗，应明确AFP是否在肝癌干细胞内有表达，而关于AFP在肝癌干细胞的表达研究未见相关报道。本研究通过观察AFP是否在分泌AFP的肝癌的癌干细胞内表达，为利用AFP为靶点的肿瘤治疗提供新的实验基础。
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　　1材料与方法3 J, [4 P0 m* z1 X: j* V6 ?

　　1.1材料

　　肝癌细胞株HepG2，宫颈癌细胞株HeLa由吉林大学中日联谊医院中心实验室提供；DMEM高糖培养基购于GIBCO公司；人AFP免疫组化试剂盒购于迈新公司；胎牛血清（FCS）购于杭州四季青公司。
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　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养
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　　将HepG2和HeLa细胞复苏，接种于10黃的DMEM培养液中（添加青链酶素的终浓度为100 U/ml），5%CO2、37℃培养2 d，用于细胞克隆。: s1 S0 D, {, j: m! r

　　1.2.2肿瘤干细胞的分离/ u% Z* w" `3 o3 \9 j! b0 }

　　参考文献〔4〕方法，利用单细胞克隆法分离肿瘤干细胞。具体步骤：用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的HepG2和HeLa细胞，吹打成单细胞悬液，以500～1 000个细胞／孔接种于6孔培养板，培养板内有玻片，37℃、饱和湿度下5％CO2的培养箱中培养，接种24 h后，吸去未贴壁细胞，培养3～4 d后细胞形成多个克隆，观察克隆形态，根据形态进行肿瘤干细胞的鉴别。
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　　1.2.3克隆细胞AFP免疫细胞化学染色, g0 M- P% }8 f2 t1 i3 k

　　细胞培养3～4 d后，在玻片上形成多个克隆，采用95%乙醇加5%冰醋酸进行细胞固定，利用人AFP免疫组化试剂盒说明书的操作步骤进行克隆细胞的AFP免疫细胞化学染色。显微镜下观察染色结果。" ?3 W% B9 p; j

　　2结果0 T8 N& a0 Q# F1 v
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　　2.1HepG2细胞克隆AFP免疫细胞化学检测结果
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　　见图1。应用AFP免疫细胞化学技术对在同一玻片上的三种克隆细胞的AFP检测结果表明，三种克隆的AFP染色均为阳性，而HeLa细胞染色为阴性，染色结果。

　　2.2HepG2细胞克隆形态特征" d4 @* z  G5 l2 m4 t. W

　　细胞培养3～4 d后，在同一细胞培养板内可见3种形态类型的克隆，即Holoclones型、Meroclones型、Paraclones型。Holoclones型克隆边界光滑，细胞呈巢状隆起生长，结构致密，细胞体积较小，这类克隆在培养板内很少；Meroclones型克隆边界不规则，细胞体积小，这类克隆在培养板内较少，但比Holoclones型的克隆数目多；Paraclones型克隆边界不规则，细胞松散，细胞体积大、皱缩，这类克隆在培养板内占多数(图2)。7 ?8 P7 v' b' S& ~1 o, t9 }

　　3讨论5 U9 m/ W$ t6 f* @

　　肿瘤干细胞是最近几年提出的关于肿瘤发生发展机制的新理论。该理论认为在肿瘤组织的细胞是不均一的，存在异质性，其中少数细胞具有干细胞的特点，可以在异体动物体内形成肿瘤，而其他细胞不能形成肿瘤，同时这部分肿瘤干细胞也是产生肿瘤化疗与放疗抗性以及肿瘤转移与复发的原因。因此肿瘤干细胞成为肿瘤治疗的又一重要的新靶目标。在肝癌治疗过程中,由于AFP在肝癌组织的特异性表达，所以常用做目标蛋白进行肝癌的靶向治疗，这种治疗方法杀伤的是分泌AFP的肿瘤细胞，而不是未分泌AFP的细胞，从而达到靶向治疗肝癌的目的，提高治疗的安全性。但根据肿瘤干细胞理论研究提出了肿瘤治疗的靶细胞应该是肿瘤干细胞。所以在以AFP为靶点进行肝癌的治疗时,应该明确肝癌干细胞是否表达AFP，如果肝癌干细胞不分泌AFP，则以AFP为靶点的肝癌治疗方案将不能杀伤肝癌肿瘤干细胞，从而影响肿瘤的治疗效果。
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　　肿瘤干细胞的分离常采用以下方法:(1)对细胞表面进行分子标记,利用细胞分选方法进行分离,这是常用的肿瘤干细胞分离方法〔5〕；(2)利用SP法分离肿瘤干细胞〔6〕；(3)利用细胞克隆法进行肿瘤干细胞的分离〔7〕。细胞克隆根据形态学可以分为为Holoclones型、Meroclones型、Paraclones型克隆,其中Holoclones型为少数,是肿瘤干细胞。采用细胞克隆法进行肿瘤干细胞的分离，方法简单，能够满足要求。本实验采用细胞克隆法分离肿瘤干细胞，表明HepG2和Hela细胞克隆在形态学上形成了Holoclones型、Meroclones 型、Paraclones型克隆，说明通过该种方法可以进行肝癌干细胞的分离。

　　HepG2是分泌AFP的肝癌细胞株，检测AFP在该细胞的表达常常检测的是细胞分泌上清中的AFP，反映的是该群体细胞的AFP表达情况，不能显示个体细胞的AFP表达情况。本研究利用免疫细胞化学染色方法进行AFP检测，可以对每个细胞AFP表达进行检测，也可以同时对三种克隆细胞进行检测，分别显示三种克隆AFP的表达情况，结果显示在HepG2细胞形成的三种克隆都有AFP的表达，而HeLa细胞没有AFP的表达，说明AFP在肝癌细胞株HepG2内特异性表达，在肝癌HepG2细胞内的肿瘤干细胞也表达。因此针对AFP为靶点的肝癌治疗可以靶向杀伤肝癌干细胞。

　　综上，在肿瘤治疗过程中一些肿瘤标志物往往作为肿瘤治疗的靶点。肿瘤干细胞理论研究认为肿瘤治疗的靶细胞应该是肿瘤干细胞，所以在实施这种肿瘤治疗方案时应考虑肿瘤标志物在这些肿瘤组织的肿瘤干细胞内表达情况。但现在的研究很少考虑这个问题，同时在进行肿瘤干细胞研究时，也很少进行肿瘤标志物在肿瘤干细胞内表达的研究。所以在以肿瘤标志物为靶点的肿瘤治疗中，检测其在该肿瘤干细胞表达值得进一步研究。' j" q* W- {0 t) ~
      【参考文献】
　　1  Reva T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer and cancer stem cells〔J〕. Nature，2001；414：10511.0 p$ Q+ j( s3 j8 k0 ]8 o. Y8 U
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　　2  Tang C，Ang BT，Pervaiz S.Cancer stem cell: target for anticancer therapy〔J〕. FASEB J，2007；21(14):377785.

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　　3  田  耕，易继林，熊  平.甲胎蛋白DNA疫苗的构建及诱导小鼠抗肿瘤免疫的实验研究〔J〕.第三军医大学学报，2006；28（15）:15914.0 P- }9 E9 |1 G) t! \

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　　4  程纪华，冷希圣，彭吉润，等.甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗载体的研究〔J〕.中华医学杂志，2000；80(6):4613.

　　5  Muhammad AH，Wicha MS，Adalbeno BH，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cell〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003；100(7)：39838.
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　　6  Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stemlike ceils in C6 glioma cell line〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004；101(3)：7816.# d% n; c5 e* W1 n  o6 l- Z! R
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　　7  LinksLocke M，Heywood M，Fawell S，et al.Retention of intrinsic stem cell hierarchies in carcinomaderived cell lines 〔J〕.Cancer Res，2005；65(19):894450.

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