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作者：余文静 综述，李著华△ 审校作者单位：泸州医学院病理生理教研室，四川 泸州 646000 ' Y& G1 q4 G/ |. Y
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5 a8 ^6 u7 i& B 【摘要】 近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着干细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。 ; l \! g, Y; t5 o' j/ \# ~: I: M+ E
【关键词】干细胞 生物特性 应用5 P0 q9 L( Q" V1 U1 p I" _, R; T
近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着于细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。' S+ O9 [& a/ N8 I+ I
$ u) o- p$ \ w1 M 1干细胞的概念
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干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。 按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞，是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强，既是胚胎发育的基础，又是机体各种细胞最早的祖先，由它可形成完整的生物个体，如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。 从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如多能造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等均属于此类。这些多能干细胞在一定条件下可分化成定向发育的、多系列的专能干细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞．专能干细胞的分裂是不对称性的，即在其所形成的2个子代细胞中，1个仍保留原来干细胞的全部特征，以维持机体内干细胞在数量上和质量上的稳定；而另一子细胞却开始分化，发育，最终形成新的具有特定形态和功能的体细胞，以对正常相应组织细胞加以补充，维持细胞器官生长与衰亡之间的动态平衡。由于全能干细胞分化发育成体细胞的过程，是一个连续的过程，也是细胞数量上由少到多，功能上由幼稚到成熟的增殖、放大的过程。
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" q# r' S/ o0 w, g. M. j5 R4 U 2干细胞的生物学特性; z. H' j! ?4 o9 M. k
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干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞本身不是处于分化途径的终端，它可连续分裂几代，也可在较长时间保持静止状态；干细胞通过两种方式生长，一种是分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，一个子细胞最终分化为功能细胞，另一个分裂成为干细胞保留下来；干细胞表现出很强的可塑性，其调控机制目前尚未清楚。! I# v G7 J% x7 c4 P: C e) I
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2.1胚胎干细胞(ESC)的生物学特性ESC细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征，有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段，其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人ESC细胞表面SSEA3、SSEA4、TI160、TRA181等呈阳性。而未分化的小鼠ES细胞表面仅SSEA1抗原阳性Ⅱ［1］未分化的ESC细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子Oct4，碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达，一旦分化，基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达，可成为鉴定胚胎干细胞的依据［2］。9 u. B: a% y1 z4 @+ }; Q l
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2.2成体干细胞的生物学特性成体干细胞(ASC)是一类具有自我更新，高度增殖和多分化潜能的细胞群，有横向分化能力。目前国内外学者研究热点是其横向分化能力。其机制还不清楚，目前被大家接受的观点主要有以下几种：（1）异质干细胞的存在；（2）原始多能干细胞的持续存在。美国的学者Jiang Y等［3］提出成体骨髓中确实存在一类被称为多潜能的成体干细胞(MAPC)，MAPC表达Oct4、Rex1，虽然较ES细胞表达低，但一般的成体干细胞不表达；（3）细胞融合，移植的1细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合，导致遗传信息的转移，形成的杂合细胞遗传了两个亲代细胞的特征，如TeradaN等［4］研究证实骨髓基质细胞通过细胞融合表现出其他细胞的表型。ASC的鉴定识别主要通过三种途径［5］：分离培养和形态学观察；免疫表型鉴定；分化功能检测。分离培养和形态学观察是最直接简单的鉴别方法：如利用问充质干细胞(MSC)在培养瓶中可贴壁生长的特点，弃去未贴壁细胞，得到MSC集落，用显微镜观察细胞形态来辨别细胞。免疫表型鉴定是目前研究最多的，虽然其特异性比较高，但所需的实验条件较高，表面抗原试剂价格昂贵，且由于大多数成体细胞没有独特的免疫标记物，只能通过排除其他细胞来确定是否为目的细胞来识别鉴定：只有造血干细胞具有特异性的表面抗原CD34,而MSC就没有特异性表面抗原，它不表达CD34、CD14、CD45，只表达SH2、SH3、CD29、CD106、CD166。分化功能检测法主要是通过观察ASC诱导分化是否能生成预期的细胞类型来反证是否该种类型的干细胞：如MSC可诱导生成成骨细胞及软骨细胞，只要通过染色等方法证实诱导生成的细胞是成骨细胞或软骨细胞即可证明是MSC细胞，此法在目前的研究中用到比较多。
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% c! }- u7 w$ Q {5 \" j3 S ]* l 3干细胞的应用3 q: u# I, |1 ~5 m
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3.1移植治疗移植治疗目前已经成为治疗疾病的一个重要手段，如器官移植、细胞移植等。干细胞移植是一个尤其重要而意义重大的手段。从20世纪80年代起，造血干细胞移植已经成为治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病的重要手段。之后，外周血干细胞移植并辅以化疗及细胞因子CG-CSF、GM-CSF等，可使更多的干细胞进入外周血。1989首例脐血治疗Fanconi贫血成功后，许多国家纷纷建立了规模不等的脐血血库。因脐血富含造血干／祖细胞、其免疫细胞的抗原性较弱、C，IL祖细胞较少、移植相关GVHD的发生相对骨髓的外周血少而轻，采集容易、对供者无任何伤害。故被认为是极具潜力的新造血干细胞的来源［6，7］。神经干细胞的研究为神经系统疾病的治疗提供了广阔的应用前景。啮齿类中枢神经细胞系包括中枢神经干细胞已被用于许多鼠的疾病模型，如鼠遗传性神经退化症，包括脱髓鞘症、脑神经节苷脂沉积症和其它神经退化紊乱(包括多巴胺能神经．如肾上腺髓质．胚胎腹侧中脑和畸胎瘤组织的移植)治疗研究中［8］。神经干细胞的临床价值已在治疗帕金森病中得到证明。
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% d! n3 c- @8 ~! A 3.2克隆动物及转基因动物的生产自绵羊“多莉”问世至今，体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端，即成功率低和容易早衰，“多莉”羊在它存活的第5个年头也终难逃一劫。而Wakayama等用长期传代(30代以上)的小鼠Es细胞克隆出31只小鼠，14只存活，可见存活率大大提高。因此KS细胞克隆动物具有光明前景。转基因动物是利用受精卵或ES细胞作为载体，通过注射目的基因，从而生产带有目的基因的动物。转基因ES细胞系将为大量同系转基因动物的生产奠定基础。应用干细胞进行动物克隆，可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产，以及高效生物活性物质的生产［9，10］。
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( @, @: b; k, z3 a& ~1 k) l z3 O 3.3转基因干细胞基因治疗现有的基因治疗有2类：（1）转基因细胞治疗。（2） 核酸治疗。前者常用的基因转移靶细胞多为淋巴细胞、成纤维细胞等。其缺陷为细胞存活时间有限，在治疗过程中需要反复输注，治疗繁琐。转基因干细胞技术解决了转基因细胞存活问题，成为转基因细胞治疗重要的方向。近年来，人类基因组测序为认识生命现象以及疾病发生的物质基础提供和建立了完整的信息库，DNA芯片技术就是在此信息库基础上对疾病诊断的方法学革命。与此同时，“分子治疗”技术也倍受关注。但是，由于蛋白质分子量巨大难以进入细胞，只能作用于细胞表面分子而发生作用，而且基因治疗有依赖病毒序列作为基因载体的弊病，因此限制了“分子治疗”的应用。(11)如何克服这些弊病，改进技术，是分子治疗领域的主要课题之一。干细胞生物工程正是改造“分子治疗”的。(1)干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；(2)干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导人体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；(3)干细胞是人体细胞，作为载体其毒性最小，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。1 R% N, e4 D1 ~7 o: b
: s/ z9 }1 S! _: B 3.4ES细胞为发育生物学研究的理想体外模型KS细胞具有全能性和无限增殖能力，并能在体外培养。因此，可以作为微环境改变对细胞分化影响的理想研究材料。随着现代生物技术的发展，研究不同生长调节因子在ES细胞分化中的作用，已成为可能。尤其是基因芯片技术的完善，通过mRNA差异显示，为ES细胞分化和不同分化阶段细胞的基因转录和表达的研究奠定基础，成为揭示发育和分化的分子机制的重要手段。, S0 P1 k4 ?; d7 O! |! h% W6 T0 a
/ h/ \1 g% b5 t! o 4存在的问题
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# C/ y4 Q. O8 i& x 干细胞研究虽然有很大的进展，但仍需解决许多难题：（1）干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题。这是所有问题的起点，如果没有扎实可靠的分离培养技术，也就没法进行后续实验研究。没有有效的增殖技术，就达不到细胞移植等治疗所需要的细胞数量。干细胞的纯化及鉴定目前虽然研究很多，但由于许多干细胞没有独特的表面抗原，所以其鉴定问题将是一大难题，需要各国科学家们进一步研究。（2）干细胞诱导分化的问题：每种组织细胞产生的诱导条件不同，这就需要研究者们后续摸索前进。（3）移植后免疫排斥反应：干细胞治疗虽然有广阔的应用前景，但利用ES细胞移植或异体干细胞移植治疗疾病过程中免疫相容性问题必须解决。一种解决ES细胞移植排斥反应，方法是从病人自身细胞的核移植分离hES细胞，这个概念称为“治疗性克隆”(12)；还可以通过暂时服用免疫抑制剂，然后逐渐停止服药；也可使用微胶囊法来阻止移植物与受体免疫系统间的相互作用等方法。（4）干细胞治疗中生物安全问题：干细胞在移植到体内后是否会分化成其他意料外的组织或引发其他疾病，这些都需要进一步的实验证实。其他的如伦理学和社会问题等等，需要学术界与政府机构共同协作，为干细胞的研究更上一层楼而努力。
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5展望
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N5 t5 C* Q- L; A v+ v 基因组、后基因组计划和干细胞研究是20世纪与21世纪交替之际中生命科学中的两股强大的潮流，基因研究正在全力构筑起生命科学的基石，干细胞的基础研究及开发应用则将打开疾病治疗的突破口，它将成为21世纪生物产业的核心内容之一。美国《科学》杂志1999年和《时代》周刊和2000年相继将干细胞生物工程学评为世界十大科技成果之首，这项研究具有重要意义和诱人的应用前景，各国科学家都在关注和进行这一领域的研究，并吸引各种资本投入巨资投入这一领域，几乎所有的发达国家均成立了干细胞公司，开展干细胞生物学研究及提供干细胞应用服务。国内天津、北京、上海、广州等高校及科研单位也相继成立干细胞研究中心及干细胞技术公司。据最新报道，中国医学科学院天津血液研究所于2001年I1月4日通过了亚洲脐带血干细胞库的验收，该库从2001年4月18日接受第一例储存脐带血干至今，已收到近3 000例脐血。南京市第一医院也将于近期用造血干细胞移植治疗严重的冠心病，使疤痕累累的心脏生长出新的心肌细胞。从目前发展的趋势看，干细胞的研究在不久的将来(3～5年)将会取得惊人的突破。如利用于细胞(特别是胚胎干细胞)培养产生人体各种组织器官，产生克隆器官，供人体移植使用，修补及替换损伤的组织器官，治疗各种疾病。但是在干细胞的研究中也存在着诸多困难有待于解决，目前急需解决的是各类干细胞分离纯化、鉴定、繁殖，它们之间定向分化的关系，临床实验应用中存在的问题等。应建立一系列可靠的技术方法，完善于细胞的建系。而且国际和国内应制定相应的法律法规，保证干细胞研究的合法化、规范化。
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