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ChIP是一项比较流行的研究转录因子( transcription factor, TF)与启动子(promoter)相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。
+ u$ J. @6 @) F) A* X' a0 `) F+ o一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联,纯化富集的DNA-片断——PCR分析。( @: `# Q, g) b( O. @8 _% \1 s
在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。6 a$ V. e: R2 z, D! W' k
第一天:
! W1 s1 W! G% g1 J' y(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。
+ o; g x9 B' ]- J% `1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有9ml)# N) J7 c& Z( A, C f% L) B
2、37摄氏度孵育10min。
) ^ w V$ w: f; d: {( N' X( H7 O: I3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。
) K4 c) A2 e2 v- A7 r: O, @( k450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。
8 U+ |+ S( w4 g' \4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
( R) p! c, ^2 U4 }1 Y' w5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
( J+ U5 N1 `1 c1 X. |: S6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。1 J& |: Z5 b, s9 B9 |
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。" V: B2 Y; h( K+ W, I
将2管混在一起,共800ul。" W# }. f' E0 `
7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。/ F$ j7 l% e7 O. C# d
(二)、除杂及抗体哺育。
' g! ]5 C$ ]9 s+ Y3 I' n: F7 H5 Y- i8、超声破碎结束后,10,000g 4度离心10min。去除不溶物质。
8 F9 }1 |& v, {: k* J! r d留取300ul做实验,其余保存于-80度。- {# _* H) l5 F) b1 P2 B
300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul 5M NaCl (NaCl终浓度为0.2M),65度处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。3 u6 c0 F# A6 M* v P( \9 G
9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
+ O( x/ h. I+ z# o5 L; I再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。9 G. o9 \- S# s- p5 b, M
10、1h后,在4度静置10min沉淀,700rpm离心1min。
5 W3 T1 \* k& c' d8 Y11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体,另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
# ^+ `. z' A5 _6 B0 H2 o6 m8 A(三)、检验超声破碎的效果。
7 H; q) M" e( F" A% S4 }取100ul超声破碎后产物,加入4ul 5M NaCl,65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
% T% Y$ J5 S, D& d; x; H第二天:/ { s% S# H4 ^+ p: @
(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。
" C" F! M% X7 G# c& V' \- k12、孵育过夜后,每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
% w2 d. o5 T, Z4 f. a4 k! O$ ^" E% C4度颠转2h。% `$ ?3 c4 D" }, @3 m4 ^! }; q3 ^' h
13、4度静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。- v, @! T) t( G5 }. `
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4度颠转10min,4度静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。& u: T" `/ }+ X. a6 h
洗涤溶液:a. low salt wash buffer—-one wash6 V9 m0 L' l1 N
b. high salt wash buffer—–one wash
9 Z3 c% Y ~2 g( e& r3 ac. LiCl wash buffer——one wash" _, Q) E9 L/ \) |* ^
d. TE buffer——two wash
# K7 @- x& g, `/ B9 H' u* L15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul 10%SDS, 100ul 1M NaHCO3, 800ul ddH2O,共1ml。6 Q- K- r }: [) K2 S9 }& n( C7 I( f
每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
# A9 J, V' f6 J# m* B16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。) I3 m3 \1 I$ y+ s( D5 ]9 o
混匀,65度解交联过夜。
; Z8 t! v4 l) i( w* s; n0 s: k+ U第三天:0 A3 @! g) K k
(一)、DNA样品的回收
' o1 q; Z! \: ?% s# Z17、解交联结束后,每管加入1ul RNaseA(MBI),37度孵育1h。. Y+ r8 m5 ] }8 Z
18、每管加入10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris.HCl(PH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
" N+ d+ e; g/ a0 a" E( s, P* i: Q45度处理2h。
9 f1 K/ w) e" M0 J5 m/ G19、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
8 q" N+ | D( _* f; @( _6 L(二)、PCR分析 2 |- _2 u) N' I( z
二、技术总结$ j1 s6 j- ^" u ]5 ^
(一)、关于细胞
" A/ k5 k$ M* p3 ?6 d3 _$ D细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。& Q1 D" w) R0 O: w/ G
一般细胞长到75%-80%比较好。" j2 e; v' W9 l0 G2 Q( m% T) @
(二)、关于抗体!% ^6 V- T5 _9 S% \9 h/ J. v4 {$ J
抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体,即使是IP级别的。
; D5 o) x; R/ z$ a* f T6 d. S单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。1 O: x6 s. h" b4 @2 H
一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。) f3 f* Z( p+ g
(三)、关于交联与超声破碎!2 a& {7 n- W$ v T; P
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。) g8 ^5 V: [% B/ ?9 }. t
交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。: w& C. u X3 ~7 E' L6 h# ~
一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。9 `0 W( v8 R" T7 k9 Z5 a
一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。
, |- |. ]% B2 K0 \! f8 Z(四)、关于操作9 p& ^/ w- I: a& M( d# L8 k9 `0 l
希望尽可能的保持低温(4度)。
. K+ h; O7 P+ A) r1 U- T# e# O# O沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。4 R6 P2 y m, g: X( H: m
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。3 q! G3 A% w7 A+ ]6 A) Y
(五)、关于解交联
9 |, z0 W' w, K" p ?* X0 h虽然说明书上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
( _" t6 P5 r( o3 V# H2 B9 l3 L(六)、关于DNA-片段的回收 T8 f$ F4 `* u, T
需要注意的是:样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。
; U# c9 Q& V% Z* T- r小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。 |
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