饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。: `( X; K) R2 n6 X' i2 M
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
' o+ Z0 |! G& t  @" y直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：; L& ]4 R# ^7 H
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。$ ]$ q, u( R; }; o
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
% M3 c) C& D. q- |2 O! u0 `（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
$ p; W1 {% ?- J0 u$ W3 ^; n（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
1 u1 ~9 |& y! t4 @7 |0 O$ @2 T（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。
% s2 p- ~1 v8 f% N9 z" r5 \（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
3 ]( H+ e: ^; I（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。, T. e1 L) v5 V8 ]1 [9 [
（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
: p  U# `2 h: e' ]（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
0 w: P# ?- A/ \- X" z; Y（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。; G' V2 L+ r! Y; x+ c- Y: m7 `0 J
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

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  a  y& `3 h  _& c9 J+ G
' C4 [3 u/ Z$ j1 `! p* [8 C想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子; W: H( u3 i4 b5 `& H& b5 \
; E+ r; G3 |1 ?6 X
这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？1 a+ q+ ^- q* r
复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
8 f% e# h6 R; `3 G8 a" N# l* N估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子3 ?! G: o! e6 L& U0 N8 \
6 n/ d& E/ x/ {
肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子4 y" }1 i$ p7 X' ~3 F; X, ]; P

7 t9 [$ K7 R# O+ E& _这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

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1 ^* g" Y9 ^! S, ~0 @2 u
; `1 N/ A; d5 @2 ?0 u: l; K+ d第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

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2 F, A8 ^5 C( h! n$ N9 W
6 _, ?/ ?, C5 B" }是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的