microRNA的qPCR结果问题

wzm123hzy

尊敬的老师们，师兄，师姐们：* x) J" c& ~  U- p7 c: E
我做microRNA qPCR时，出现：做了3个内参，其中一个有杂峰，一个无CT值，一个正常。5个unknown里有一个没有CT值，还有一个出现双峰，其余3个正常。求老师们，师兄师姐们，不吝赐教，非常感谢。

zhoujp3651

这样的溶解曲线显然是不对的。引物结合的位点可能不唯一，建议用总DNA先做普通pcr看看条带，或者用cDNA也行。
/ d# k( |+ W  c+ K' R+ ?

zhoujp3651

另外起峰循环数最好在15-25之间，30以上是肯定没有意义的。

wzm123hzy

是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?

细胞海洋

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7 N: [0 G/ E; n
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样# R* n3 w* J3 ~& Q  h2 |+ C0 _
: I, [& J3 w% J1 }
否则他会看不到

wzm123hzy

回复 细胞海洋 的帖子' t8 N  j  U! t* U) f' @3 u

. ?2 |' A7 N. G0 b好的，谢谢老师

wzm123hzy

回复 zhoujp3651 的帖子
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老师，您好，请问是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?
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Yedan

7 t1 ?( e1 `8 u/ p

" {  p' I! i9 r+ J8 ?0 T回复 wzm123hzy 的帖子
$ w. l; |% d4 t. W- h" q8 v7 b$ Z1 m) `9 f, V
miRNAs的定量检测引物不是针对那20bp左右的序列设计引物的，在你做反转的时候，就会把miRNA成熟序列加长，要么是用针对每个miRNA特异的反转引物，要么用Oligo，检测的时候产物长度会加长到90bp左右（每个公司的kit不同），所以你看你每对引物的溶解峰温度，就知道PCR对不对，再者跑完的PCR产物可以跑个2%胶，如果条带单一位置正确，说明你的PCR没问题。

wzm123hzy

回复 Yedan 的帖子8 u1 m; a$ _( k

% a& Z! ]5 [! e好的，谢谢老师。我再跑个2%的胶试一下。