George Church专访：CRISPR如何引领基因编辑革命？(ZT)

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      11月26日，Nature Communications杂志发表了遗传学界的大牛George M. Church领导哈佛医学院的团队，在人iPS细胞中进行了CRISPR基因编辑。他们将全基因组测序和靶向深度测序结合起来，评估了Cas9编辑iPS细胞时的脱靶效应，还鉴定了一个影响Cas9特异性的单核苷酸变异（SNV）。
' r; n! j# S1 w# o       CRISPR基因编辑和iPS重编程是近年来的两大热点技术。CRISPR/Cas9已经在多个领域中展现了自己强大的特异性基因靶标能力。而iPS重编程在构建疾病模型和新药开发中有着很高的应用价值。将CRISPR应用到iPS细胞中去，似乎是一件大势所趋的事情。) z0 b6 l) X2 G
       11月30日，美国波士顿发行量最大的报纸《波士顿环球报》对George M. Church进行了题为“A Tool to edit DNA revolutionizing research in Boston area”的专访，本文是对其专访稿的翻译。
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% @. P) r0 J5 s3 a9 L) ^$ [  fCRISPR技术诞生的背景意义! g4 ^3 m7 r/ v& f2 B" L
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       我们的自然界存在许多奇怪的生物现象：例如构造简单的微生物（细菌）却存在具有记忆功能的免疫系统。微生物（细菌）经过一系列外界刺激后，它能够迅速记住其中的变化模式，并在下一次刺激到来之前作出相应应对措施。
  `8 M$ x, T+ l4 ?, Z' V       科学家关心这些现象不仅仅是处于对科学的好奇心，我们更加在乎的是细菌来改造生物的机制。通过这种CRISPR技术，提高了基因组的编辑精度，即科学家剪切和插入合成的DNA片段的速度，创造了许多动物模型来治疗人类癌症，或者是创造了血红细胞来抵抗HIV病毒。
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CRISPR从发现到应用的历程
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       CRISPR基因组编程技术是近两年兴起的一种新技术，2013年两篇Science新闻开创了CRISPR基因组编辑技术的新时代，随后生命科学界刮起了 CRISPR风暴，迄今为止CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA突变和编辑的一种重要技术。
: n7 [' w3 J- [  o# j: p4 c       RISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。直到今年科学家们才开始利用这一系统在活体动物基因组中生成靶向突变，删除原有的基因或插入新基因。
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8 P  k8 d2 Q3 {! Y; X4 {9 YCRISPR技术的优点
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       与过去数十年里进行基因工程的其它任何方法相比，CRISPR技术的优点就在于它使用的是单一的酶。这种酶不需要改变你设定目标的每一个点，你只需要使用 一个不同的RNA副本对它进行重新编辑，这很容易设计和实现。
7 `; c5 e0 f& p       生命科学突破奖获得者中有几位科学家则分别是在遗传学，RNAi等领域的突出贡献而获奖，如 哈佛医学院遗传学教授加里·鲁夫昆就是一位微小RNA(miRNA)研究领域的著名科学家，他曾发现了首例微小RNA：lin-4通过与目标信使RNA不 完全碱基配对，来调控这些目标的翻译的机制，并发现了第二个微小RNA——let-7，以及它在动物（包括人类）系统发育中如何保护的。% ^0 Q7 n9 D1 A3 T9 ]1 H! }
       2008年获拉斯克基础医学奖（Albert Lasker Basic Medical Research Award）。 miRNA是一类非编码小RNA，其长度为19到25个核苷酸，在真核生物的多种发育和生理过程中发挥着重要的调节作用。加里·鲁夫昆等人就曾通过分析比 较了86个不同真核基因组序列，分析了小RNA辅助因子的系统发生谱，并指出，在RNA剪接和小RNA介导的基因沉默之间存在密切关联。
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6 {3 t6 {7 [1 H  ~9 Y( @" E1 `' MCRISPR技术给波士顿地区生物工程发展带来的影响？/ x% B. Y* Y2 J6 U* p, h% o$ [/ [
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       “美国雅典”的波士顿（英语：Boston）是美国马萨诸塞州的首府和最大城市，也是在人口上美国的第21大的城市。今天的波士顿是高等教育和医疗保健的中心，它的经济基础是科研、金融与技术—特别是生物工程，并被认为是一个全球性城市或世界性城市，哈佛大学、麻省理工及威廉姆斯学院等世界名校都坐落在这里。3 h- e6 `4 Z- C
       在波士顿地区，有2家公司治疗，与基因变异相关的疾病。与此同时，几乎每周都能看到基因编辑工具被用于一个新的领域：MIT研究者已经构建了带有肝脏肿瘤的老鼠模型；哈佛大学的研究者通过基因编辑来破坏并降低小鼠体内的胆固醇水平；波士顿儿童医院的科学家利用干细胞，重组了基因变异引起的血液罕见病。2 v7 U* o# U  l+ k

  ~. ~5 N$ E  L6 d2 u9 C7 e波士顿地区与CRISPR技术相关的公司% H) L& ~2 b, N  z8 \2 t
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       目前，波士顿地区与CRISPR技术相关的公司有2家：Editas Medicine，是一家利用基因编辑技术进行基因治疗的公司；另一家CRISPR Therapeutics 开展的业务也与Editas Medicine相似。, d1 v5 k* X- {* H( @
       另外，波士顿许多其他领域的科学家也陆续采取这项技术作为他们感兴趣领域的工具。例如：癌症研究者发CRISPR可以用来驱动癌症，过去几年都一直用的是老工具。% d3 O5 Y1 c( _  j9 b- J

' s9 \9 P) o4 H" O生物界对CRISPR的评价% F2 L' I1 B" }1 q. u

3 S; I' x  i; r; R* x       美国马萨诸塞州博大研究院的创始人Eric Lander（Eric Lander是国际人类基因组计划美国部分的主要贡献者，开发了很多用于现代基因组研究的工具软件）表示：最让人惊讶的是，细菌已经在10亿年前发明了这项技术，然而当我们为人全基因组和小鼠全基因组设计这种方式时，作用机制却不是那么明朗。“CRISPR”技术真的是一个强大的工具，在不到2年的时间里，从一个不太确定有用的idea中，到目前所有的毕业生都将“CRISPR”当做一项常识( l$ Q) b4 ~% f  [' B
        德国亥姆霍兹感染研究中心）的艾曼纽·卡彭特（Emmanuelle Charpentier）及美国加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）表示：“修改生物体基因特定部分的能力，对于增加 我们对生物体的认知是必不可少的。这是该领域的一种巨大跨越，因为它意味着基本上任何人都能够使用这种基因编辑或者重新编写的技术带给哺乳动物基因变 化。”
4 O! `, b9 N0 K3 K, k       马萨诸塞州总医院病理学副主任Keith Joung博士表示：当我第一眼看到CRISPR基因组编辑技术论文时，就觉得如果这是真的，所有的游戏规则将改变。正好在接下来的几个月里，博大研究院的 Church和张锋（Feng Zhang）展示了“CRISPR”技术的魅力：采用这项技术对小鼠和人源细胞的基因进行编辑，发现“CRISPR”可以再有机体内进行编辑，并对斑马鱼胚胎的基因组进行编程。
3 d8 \4 G- e) U% y       麻省理工学院科赫研究所综合癌症研究中心的 Tyler Jacks表示：CRISPR方法真心很强大，现在我们实验室几乎每一项目都会用到这项技术。
1 I- S8 Y" i+ D+ L/ n       哈佛大学干细胞与再生生物学研究所也用到了这项技术，顺利删除了感染HIV病毒的必须基因——CCR5。研究所副教授Derrick Rossi表示：过去的基因编辑工具远不及现在的CRISPR技术。其最新一项研究利用CRISPR Cas技术有效及精确地编辑删除了直接从患者处采集的细胞——人类造血干细胞和T细胞中的临床相关基因，构建出了一种能够阻断HIV侵袭和破坏患者免疫系统的有效治疗方法。7 ~- e2 o1 Z9 i
       麻省理工学院科赫研究所应用生物学Daniel Anderson教授表示： 基因组编辑技术CRISPR治愈成年老鼠活体所患的遗传性肝脏疾病将很快用到人身上，说明Crispr的技术可对庞大的脱氧核糖核酸(DNA)数据库作出研究人员所称的高精度微调。
$ m  \8 E& x, t       哈佛大学干细胞与再生生物学系生物学家、诺贝尔奖获得者Craig Mello表示：正是有了CRISPR，使得过去一切不实际的想法变成了可能。其补充道：我们的生物机体究竟是如何工作仍然是一个谜底，我们也仅仅是刚刚迈入了这个“生命”领域的边缘。/ s$ K5 I( Y! h+ b! x
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如何评价您的工作？
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        过去几十年的时光里，生物学家尽管知道研究细菌的DNA及它们复制的起点，但是那似乎看起来漫无目的。随后的十年时间里，这一遗传学问题逐渐明朗，并且提供了一个简单的方法，使细菌插入和剪切，通过带有噬菌体的病毒。
3 W! _1 x! U( W5 J+ y3 ~       George Church表示：我是一个技术狂，年轻时，我会采取不限于生物学的各种技术手段，也使得我看到了许多罕见的食物。我曾预测到将来可能会在人体细胞中编辑基因，于是一旦将实验室组建起来，就立马投入这项工作，并且发现在人体细胞中编辑DNA很有效。
* W* l" T3 o) U: F4 T       CRISPR（全称clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） ，是2012年由加州和欧洲的科学家共同发现，并被寄希望于获得诺贝尔奖。但是其快速增长和广采用，却是由我们波士顿的科学家来传播的，例如将斑马鱼胚胎中细胞移植到小鼠和人源细胞中。这项技术的广泛应用使得“CRISPR”也逐渐由一个短语变成了一个动词，很多科学家在要剪切或者删除基因时都会提到 “CRISPRing”。
9 v" S* o1 s" m; Y: B, A' [; u了解更多：$ l0 |1 p8 e& w4 v7 E. u( w  m# ]$ ?
Tool to edit DNA revolutionizing research in Boston area

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marrowstem

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       两年前，一个缩写为CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律间隔成簇短回文重复序列）的基因编辑工具横空出世，席卷了许多实验室。而在这一系统被开发的数亿年前，细菌和古细菌就利用其非常精确的对几乎每个基因组中的任意序列进行精确修改了。
6 I5 H7 m( ^! S" A+ g2 n$ M       而且这也不是生物学家第一次利用到CRISPR 的作用。早在十年前，奶酪和酸奶制造商们其实就已经通过 CRISPR 生产能够更好抵御外来噬菌体的发酵材料。“这是一种非常有效的去除病毒的方法，”杜邦营养健康研发部主任Martin Kullen说，“CRISPR 一直被用于解决食物浪费的问题”。
0 B7 H$ \7 s0 U( ^/ \  I      发酵过程中噬菌体感染是乳制品生产过程中一直存在的问题，也是一个重要的问题。据世界著名的丹麦科汉森（Chr. Hansen）公司估计，全球大约有2%生产出来的奶酪都受到了噬菌体的攻击。这种感染还会减少牛奶发酵剂的酸化过程，导致奶油生产商产量锐减10%。
- B  b% j8 l. [' ~       然而故事在本世纪初出现了转机：Philippe Horvath和Rodolphe Barrangou等人完成了嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的测序，并首次引入了CRISPR的概念。& `: N1 \' g2 f' d1 e: }; a0 K
最初他们并不知晓CRISPR序列的作用，但是当研究人员完成了不同菌株的测序后，他们发现了 CRISPR 可能与噬菌体感染，以及随后的免疫防御有关。
. u; ^. c+ j; ^1 H/ }1 ~! H0 D8 a       在几年后，这一研究团队得出结论， CRISPR 序列确实能给予细菌噬菌体抗性，这篇文章发表在Science杂志上，研究人员指出细菌能从威胁它们的病毒上借遗传序列并将其结合到自己的基因组中，从而试图躲避病毒未来的进攻。这种独特的防御系统就包含了CRISPR重复遗传序列。
1 M# q0 l8 b  ^       CRISPR片段在重复段之间有与威胁细菌的病毒序列类似的“间隔区”序列。从这项研究中，他们发现对乳制品生产很重要的嗜热链球菌能从进攻它们的病毒上获得新的间隔区序列。一段时间后，这些新的间隔区序列使细菌对病毒有免疫，可能是通过沉默病毒基因的表达。5 t: ]/ a6 Z7 z+ @# J. I" j
       杜邦公司对这一技术申请了不少专利，因此这样的细节都是保密的，但基本来说乳品生产商都已经知道了部分秘密，他们也会用这种方法来防止细菌受到攻击。. p3 k9 q$ m2 f* \- y; [
“CRISPR 并不是对抗噬菌体的唯一机制，但这是一个有效的方法，”Horvath说。通过分离这些“CRISPRized”细胞, 食品科学家能得到新的培养物，用于对抗多种病毒的侵袭。6 v0 ]: \& o2 A
杜邦于2007年开始进行这方面的研究。在2012年，该公司宣布了第一个CRISPR商业应用：制作披萨芝士。但是这种方法也并不是完美的，这种所谓的CRISPR逃避突变噬菌体（CRISPR-escape mutant phages）可以通过遗传突变，逃脱免疫的追击，改变DNA从而不再是匹配序列了。
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原文检索：7 G- b8 N7 a* ]& I5 r- H: Z
There's CRISPR in Your Yogurt

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  Z& ~0 v! z+ ~' ^ Science：CRISPR-Cas9系统的历史和未来
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+ Z2 g! [/ R+ @4 }' A      用RNA指导的CRISPR-Cas9系统的动物和植物基因组工程，正在改变着生物学。与其他基因工程工具相比，这种技术更容易使用，并且更有效，因此，在其发现后的短短几年内，就已经被应用于世界各地的实验室。2014年11月28日，著名的《Science》杂志发表综述文章，描述了这种系统的快速采用和发展历史。这篇综述是由CRISPR-Cas9系统的发明者、亥姆霍兹感染研究中心（HZI）教授、德国汉诺威医学院和Umeå 大学的Emmanuelle Charpentier博士和美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授共同撰写。7 x) x1 e$ v/ d% x) U
      许多疾病是由一个人DNA（组成基因的字母编码）的改变造成。一个基因中确定的字母顺序通常编码一种蛋白质。蛋白质是人体的“劳动力”，负责保持身体运转所需的几乎所有过程。当一个基因发生改变，其蛋白质产物可能就失去其正常功能，可能会导致疾病。HZI研究部门“Regulation in Infection Biology”主任Emmanuelle Charpentier教授指出：“因此，对基因组做出位点特异性改变，是阻止或治疗这些疾病一种有趣的方法。”因此，自从DNA结构被发现以来，研究人员一直都在寻找一种方式来替换遗传密码。0 ~# l- V0 F* r2 d& K; `
       第一种技术，如锌指核酸酶和合成核酸，称为TALENs，是一个起点，但是被证明比较昂贵，对于初学者比较难以操作。Charpentier说：“现有的技术都依赖于蛋白质作为地址标签，为任何新变化定制新蛋白以引入DNA，是一个繁琐的过程。”在2012年，她在Umeå大学工作的时候，描述了现在正在彻底改变基因工程的技术：CRISPR-Cas9系统。+ L  J  o# s* m0 _; ^. z6 `8 h3 |$ I( O
这种系统基于细菌和古细菌的免疫系统，但是在实验室也是有价值的。CRISPR是成簇的规律间隔的短回文重复序列，而Cas仅仅代表CRISPR相关的蛋白质。Charpentier说：“最初，我们发现了一种新的RNA，即tracrRNA，与CRISPR-Cas9系统相关，相关研究结果我们于2011年发表在Nature杂志。我感到兴奋的是，我实验室的Krzysztof Chylinski随后证实了一个长期的想法：Cas9是与两种RNA一起使用的一种酶。”
, O: L" c5 J' ~; x; ^3 h/ H3 K3 H       同时，该系统具有检测遗传编码内特定字母序列以及在特定位置切割DNA的能力。在这一过程中，Cas9蛋白起剪刀的作用，RNA小片段起地址标签的作用，确保切割发生在正确的位置。通过与Martin Jinek和Jennifer Doudna合作，该系统可以被简化，将其用作一种通用的技术。现在，用户只需要更换此RNA的序列，就能靶定基因组中几乎任何的序列。
# N* a2 z1 v. Y1 u$ t7 D2 I3 ?- S       在2012年描述CRISPR-Cas9的一般能力之后，在2013年初，有研究表明它能够像在细菌中那样，有效地作用于人类细胞。从那时起，来自世界各地的研究人员一直都大肆炒作这个新的研究领域，提出这种新工具可以用于许多新的领域。可能的应用包括：从开发基因突变所致遗传疾病的新疗法,将CRISPR-Cas系统用于抗菌“基因疗法”，到改变未来农业研究的步伐和过程,Cell子刊：基因编辑水果即将来临？，一直到开发可能的新方法抗击艾滋病毒HIV,用CRISPR编辑HPV基因杀死宫颈癌细胞。8 _& |) U: e. g4 @/ B6 m7 m
       Charpentier表示：“CRISPR-Cas9系统已经突破了界限，使基因工程技术更加的通用、有效和容易。它的应用似乎真的没有什么限制。”) q( q' ?% i- M4 ?
原文检索：
% o. ]" _# X4 h4 r, yJennifer A. Doudna and Emmanuelle Charpentier. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 28 November 2014; DOI:10.1126/science.1258096
3 B# |' f( I; G9 x(转载，来自生物360)