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标题: Taqman探针法——PCR体系的建立 [打印本页]

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作者: xiaolong523    时间: 2014-9-25 17:10     标题: Taqman探针法——PCR体系的建立

1、引物、探针的设计：  K2 p" ^. D8 |# h
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，2 B* _; `/ s& ?1 i2 V8 ^
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 8 j' }+ m1 _6 S+ {/ q

$ |% U. f8 k3 I' U( |' w2、反应参数的确定：
  J4 Q+ Q- Z' a' X/ h       一般为：94 ℃，10-20S0 B( |( k; j& I2 E& A# z
                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
. `* r! z8 \, e5 C: ]$ B9 G                       e% l8 e1 e' E6 y& U, d* G8 [# ^
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
: E: [2 F/ j) d( A& S6 V       引物浓度：50-900nM1 _9 V! e0 \6 ~
       探针浓度：50-250nM
3 L8 w- j% r3 i, ?  m

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作者: Tlexander    时间: 2014-12-23 18:05

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