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标题: 求指导NK细胞培养 [打印本页]
作者: yangpan521    时间: 2014-8-4 16:36     标题: 求指导NK细胞培养

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊& o, q9 o  S& C0 \# p
培养材料：
1 B1 M2 V9 Q8 o4 z9 t无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆% Z. |* y0 v0 C1 b% K) b  K
细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
" k4 z" L0 q9 }& }操作步骤：
6 X: i6 @2 k* F3 [- A% @3 K( p- j1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
8 N- j' \8 w' y, I2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
8 R7 e, V! l2 B- x. A3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。2 T  T9 m' J+ O  j; [
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
$ A$ A" l4 f& @- B% r. M5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。, h8 q5 v; f1 h& Q! H( f
作者: pppjjj    时间: 2014-8-5 10:00

大约能扩增多少倍啊？
作者: yangpan521    时间: 2014-8-5 10:20

回复 pppjjj 的帖子' V$ v4 ]' L  @. i" ^
/ y' i9 Q2 e% e0 R
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了
作者: wind789    时间: 2014-8-5 11:34

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？
作者: gondobar    时间: 2014-8-5 11:43

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……
作者: yangpan521    时间: 2014-8-5 13:24

回复 wind789 的帖子
9 z/ t2 f: g1 c9 F9 d& `
! |* {  v+ b6 z- u, ]8 _2 A20%左右
作者: yangpan521    时间: 2014-8-5 13:25

回复 gondobar 的帖子
9 K+ B/ G- K$ O7 Z% v" Q9 ^3 B# V+ _. {( E" @4 S
请问我上面的培养不骤没什么问题吧
作者: gondobar    时间: 2014-8-6 11:21

回复 yangpan521 的帖子" V, ]. |$ P1 H2 Z2 [
3 R+ }( `  k" ^! \
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。
作者: wind789    时间: 2014-8-6 11:25

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
  G6 R+ O. c. ?: v6 w: U回复 wind789 的帖子
$ F8 h0 E: k* _& k+ ^/ a9 N8 k2 G) b# n( J$ O
20%左右

0 s! P' u' Z) I2 x1 u% W这种比例还算是NK吗？
作者: 单个核细胞    时间: 2014-8-6 11:34

本帖最后由 细胞海洋 于 2014-8-7 09:39 编辑
( S" o7 G+ N8 [6 Z5 d' X
: Q5 g+ }6 a. {3 z5 g! g: _回复 yangpan521 的帖子/ k; `' G; A. s7 z- ^7 D  ~1 i

! D  O6 u, n8 H/ `% V+ H6 \2 F推荐阅读：4 J+ f* _% X2 a* z

8 r& ^6 |; q, v2 H  q$ `6 I- JExpansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells2 E3 V! Z' ^9 e* ~/ r2 h
http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood" K1 ]" ^9 ^* u- t0 I

& z* U  p! H4 [% n3 i3 h' ]8 F方案：[attach]63227[/attach]
1 L" _" L3 U, Y, ~! ]2 r
- c/ X# V1 t* c) D4 p  p2 |& G, ]物料：[attach]63228[/attach]
作者: jianglei_sd    时间: 2014-8-6 11:40

用CD3单抗和IL-2刺激起来的，而且CD3-CD56+只占到20%！这怎么能叫NK细胞呢？
9 Q. D! c2 u* U( @
3 y) ^; M+ ]' J. j, R, ?这不是CIK吗？
作者: a52602589    时间: 2014-8-6 12:16

一般2D补液。计数都翻倍。14D后一般扩增300倍。脐血流式40%以上。外周血30%
作者: yangpan521    时间: 2014-8-6 13:51

回复 jianglei_sd 的帖子9 k1 V0 _. K: s8 @- ^& U: ]7 c8 C3 _

" _8 H3 t5 v" Y. U: G8 \: }还在摸索阶段，请指导
作者: yangpan521    时间: 2014-8-6 13:52

回复 gondobar 的帖子+ [2 h  t; P! k3 N" k  v

' Q6 n" K2 O! ~: ?6 ~请问你是怎么分离的，我还在摸索阶段 ，有很多问题，请指导，谢谢
作者: Hi'Kitty    时间: 2014-8-6 20:46

以前我比较50ml离心管和15ml离心管分单个核细胞的量，结果15ml的离心管分的更多一些，建议可以用15ml的离心管分离试一下。
作者: sonsyoran    时间: 2014-8-12 14:15

我们分离单个核细胞的时候不稀释，因为稀释的时候会将血浆也稀释了。添加的血浆不要超过10%，不然细胞会不爱长。另外你们是有什么特殊原因要定在10天么？我们这是14天
作者: sonsyoran    时间: 2014-8-12 14:53

用饲养细胞那种好像活性会好一些，不过真的是不太可行，本身就属于癌细胞，伦理上过不去吧。怎么跟患者解释这些问题都有，所以我们没采取这种方法。
* [& X3 z& j( C/ ~" t, V我们家是用的日本一家公司的技术，他们提供培养基，然后教给你操作流程。效果还是不错，就是比较贵。所以我也没办法把具体流程透漏给你，希望你见谅啊
作者: alicia_86    时间: 2014-8-18 09:06

回复 单个核细胞 的帖子; ?. t6 r0 d1 a! p6 s# ~

! [* V/ V+ E0 X+ ]NK的培养瓶，提前孵育效果会更好。
作者: yanglixia1984    时间: 2014-8-19 17:09

回复 wind789 的帖子7 g  y) A& m. L2 j5 Q4 p

- p. ~5 f) B+ U  z那NK细胞怎么样才算是培养成功呢？
作者: yanglixia1984    时间: 2014-8-19 17:10

回复 gondobar 的帖子) M" w/ J" f4 r  E% }

! `: B6 K! {! A6 |, m" y" x想问一下NK细胞回输标准是什么
作者: alicia_86    时间: 2014-8-20 10:33

回复 yanglixia1984 的帖子2 v, H3 u8 n- S' ?! u
; `. W  W' z$ R. p$ c% I, s6 U
应该和CIK差不多，10的十次方就可以了。。看你是一次回输完还是分次数回输。最重要的是看你采血量！
作者: yanglixia1984    时间: 2014-8-20 10:34

回复 gondobar 的帖子
; t4 ]: B4 u" p5 ]* R! W( [, k/ P8 y8 E
你好，我们分离得到单个核的步骤也不一样，是直接用fillco分离血液的，血液的稀释比例1：1，一般得到的种子细胞能到3*107 你们是用什么方法能达到5*107呢，能分享一下吗
作者: gondobar    时间: 2014-8-20 10:53

回复 yanglixia1984 的帖子
; x$ B, ?3 a4 v& \" N) h; u
4 }. |3 i, X- ~$ _* ], E标准上写着：细胞数量应满足临床最低需求，存活率应不低于80%。一般回输1~3乘十的九次方，活率越高越好啦!
作者: gondobar    时间: 2014-8-20 10:59

回复 yanglixia1984 的帖子
2 W# I! h0 E; m3 U$ a
9 D1 S' c, r. ^4 z8 |其实你们数量也挺可观啦！我们也1:1稀释，不过我们不是直接分离全血，毕竟还要先离心取血清。可能和吸取手法有关吧。
作者: pppjjj    时间: 2014-9-1 09:35

回复 yangpan521 的帖子
' P: V! R. P/ e+ Q: S
; |0 N* n3 s! g$ ?  k一直用T75培养瓶培养吗？
作者: yangpan521    时间: 2014-9-4 08:10

回复 pppjjj 的帖子; Z: H/ U/ v3 {/ a' E5 N" \8 Q
9 u" {8 e) Z' x- R: }
不是，还要转袋培养
作者: CELL007    时间: 2014-9-10 14:57

那就和CIK培养一样了。你们单次细胞回输量多少啊？
作者: xuning1106    时间: 2014-11-5 19:13

把培养液GTT551换成GTT561，虽然都能培养   淋巴细胞、DC细胞培养基；但561主打NK细胞培养基
作者: chenlin080102    时间: 2015-4-15 13:29

单纯依靠这些基本的因子是很难扩增起来的，就算长起来也纯度不高，你需要选择合适的刺激佐剂！
作者: 六弦七品    时间: 2015-4-17 10:31

加液就行了，不用半量换液。
作者: mengnancy    时间: 2015-4-20 11:09

基础培养基用LONZA的x-vivo培养基培养,试过之后NK比例40%左右.
作者: mengnancy    时间: 2015-4-20 11:10

可以用羟乙基淀粉沉降红细胞后,再用ficoll分离单个核细胞.
作者: mengnancy    时间: 2015-4-20 11:11

两步法细胞回收率会更高,50ml血可分离到3*107以上,可以试一下.
作者: mengnancy    时间: 2015-4-20 11:11

两步法细胞回收率会更高,50ml血可分离到3*107以上,可以试一下.
作者: chenlin080102    时间: 2015-4-29 13:34

因子配方还有待优化，我的能增长120倍，纯度近70%
作者: 细胞海洋    时间: 2015-12-9 20:15

回复 yiyuan0530 的帖子
% I- A. N! L: p1 M1 n) w% ~5 C% g4 Q2 [% U
有问题请直接发帖
作者: guanjun1314    时间: 2015-12-10 09:38

这种方法，90足以满足要求了吧
作者: 只因偶然    时间: 2016-4-25 23:11

回复 chenlin080102 的帖子) j/ D7 T% t  {# G6 J, `

/ J) W7 ^' {# Q( F0 k% [2 W你是陈林？



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