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标题: 吸取单个核细胞时（也就是吸取灰白色细胞层）的问题 [打印本页]

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-8 13:45 标题: 吸取单个核细胞时（也就是吸取灰白色细胞层）的问题

书上说吸取灰白色细胞层时，沿管壁吸取，但是实际操作时发现，在管壁的边缘有一圈细胞絮状物，有颜色，如果吸取的话，离心后，细胞中混有的血小板和红细胞很多，如果不吸的话，离心后的细胞数量少，但是够白，怎么办？大家都是怎么处理的

作者: pailishi 时间: 2012-8-8 14:49

我们是吸取了的，虽然混有血小板和红细胞，但不影响种植贴壁

作者: zhujiang007 时间: 2012-8-8 14:53

我的做法是从白膜层的中间吸，如同将树连根拔起一样，将膜整个吸起来。我们认为混有少量的红细胞关系不大，通过换液自然就去除掉了。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-8 15:42

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恩啊，那样看似不错，但是当你用吸管吸到量程极限时，你会停止吸液，这个时候会造成一个冲击对液面，如何处理啊？

作者: zhujiang007 时间: 2012-8-8 16:14

回复突击兵之小土豆的帖子, ]: T8 s n/ k( Y8 E
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我使用25ml的移液管在50ml离心管中吸，貌似不存在你说的情况。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-9 09:05

回复 zhujiang007 的帖子7 p; S8 b6 v! W( K

强悍，我们用10毫升吸管吸，所以有那个问题

作者: bsx1111 时间: 2012-8-10 16:07

我们用3ml一次性吸管，慢慢吸多吸几次就可以了

作者: wcforever126 时间: 2012-8-10 21:17

红细胞及血小板随着换液后就会除去，如果是贴壁的要用PBS液冲洗，那样可以去除悬浮细胞。

作者: 穿越地平线 时间: 2012-8-11 06:07

可以重新加入淋巴细胞分离液上再次离心一次

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-13 09:40

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你的回答和我差不多一样，但是在操作上，你的速度控制如何呢，尤其是角度，要不不容易观察。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-13 09:40

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大姐，我们不是研究，生产要注意成本的。

作者: wcforever126 时间: 2012-8-13 11:34

回复突击兵之小土豆的帖子8 x0 F* c, j9 b8 j6 K* `

我们实验室的老师说，有些红细胞及血小板对实验没有多大的影响，比如你要提间充质干细胞，加的培养液是低糖的，而大部分红细胞及血小板在这个环境中不宜生存，所以随着换液，他们都会被清除掉，不过我见有些帖子说红细胞也有贴壁的，具体原因我也不是很清除。至于操作速度方面，我提的骨髓的，量比较少，都是先将上层血清移的差不多了才吸白膜层，我看过一篇报道，说白膜层上方1-2mm的血清层还含有间充质干细胞，所以我都会留些血清一起吸走，到目前为止，也没见红细胞及血小板对实验有什么影响，角度问题最好吸吧，其实你不知道发现没有，你枪头或者移液管放在白膜层部位，它总是先把该层吸走再吸上层，也就是说你只要不把移液管放在淋巴细胞分离液层就可以了，这个应该可以用物理现象解释吧。一些见解，不对请指正。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-13 12:55

回复 wcforever126 的帖子# L3 x$ s# O F! ~) U' ?' \5 W+ O3 M

谢谢，学习了

作者: 肉丁 时间: 2012-8-13 16:56

细胞量大时，壁上是会出现肉眼可见的一圈白色物质，但是同志们，那是细胞啊，如果不吸会影响细胞得率的，红细胞啥的，换换液就没啦

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-14 08:57

顶楼上的赞一个看帖要回帖必须的

作者: shy8610 时间: 2012-8-14 12:54

最好选用无菌的巴氏软管，将管尖直接伸到白膜层底部，轻轻吸取，边吸边向上走，可以适量混入点上清保证白膜层充分吸完，但上清不能吸太多，不然富集白膜的效率会下降，另外注意的是血样处理前要注意保温，气温低容易导致白膜分离效果差，我们的经验是健康人的白膜层大多清晰明显，病人的（尤其是慢病毒感染后的病人）差点，楼主可以抽自己的血练习，熟能生巧

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-14 15:14

一点点回复楼上，总是出现填用户名和密码的谈话窗，无语了。先顶一下楼上，哈哈，说真的你挺幽默的，首先，俺们是个瘦子，血吗，虽然每个人血量都差不多，不论高矮胖瘦，关键，我如果天天练习，就剩皮包骨了，哈哈。玩笑归玩笑，对于你的观点，我估计没戏用啊。
首先，巴氏软管，俺们听说过，度娘给我看过照片，很贵，没用过。
第二，你说将管尖伸到白膜层低，我觉得太秒了，越洗越少，液面下降，将白膜都吸走了。但是，这个方法只限于巴氏吸管，因为其管尖小，如果用一次性吸管10毫升的话，管口大，再加上电动移液枪控制不是很容易。好像这个方法对我也不太好用啊。不过我决定下次试试。: y8 c, i9 U" E H E
顺便提一句，我一般都是很多50毫升离心管操作，血比较多，时间上要提高效率。

作者: 细胞海洋 时间: 2012-8-14 21:48

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3 y' w8 B; D/ ^/ L" i T
1.换一个浏览器用ie内核的

2.你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样
P% a2 w# z( _0 o% W9 Z( H
否则他会看不到

作者: 细胞海洋 时间: 2012-8-14 21:48

回复 shy8610 的帖子! ?2 u1 k2 j$ P3 s- a. |- ` |

看17楼

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-15 08:44

回复细胞海洋的帖子

哦知道了不过我还是喜欢用360浏览器这个有时也能用像今天就可以呵呵

作者: shy8610 时间: 2012-8-15 09:54

回复突击兵之小土豆的帖子2 g; i4 A- p# S3 R7 E+ z# u1 f2 W
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土豆哥，你好，很高兴与你讨论，我知道我的文字表述能力有限，是这样的，我们分PBMC是2种，1种是200ML健康人，1种是40ML病人的,一般先除去血浆，剩25ml的固体物，用无菌pbs调整到35ml左右，充分混匀，缓慢小心铺在15ml的fercoll上，形成明显分层，离心后，如果血液状态好的，是可以十分清晰看到白膜层，比较扁，我们用巴氏管就直接伸到白膜层，吸得控制，尽量多吸白膜层，可能适量混入上清，不可混入fercoll,为什么我说要边吸边上走。然后练手的事情嘛，我刚开始做的时候，吸不好白膜，就抽自己的血练，当然这个看个人，也可以拿实验样本练，看条件咯

作者: shy8610 时间: 2012-8-15 09:58

本帖最后由 shy8610 于 2012-8-15 09:58 编辑
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回复突击兵之小土豆的帖子2 h3 s( D! `; E5 s& n3 z2 x+ R( I: x
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不好意思，再补充一下，等自己熟练了，你完全可能用电枪带着10ml的移液管吸，呵呵，我现在就这么干的，不影响效率，我们一般样本半夜到，通宵分血，一分就是40-60份啊，时间效率么问题，但言归正传，如果没把握，宁愿慢点，这是最重要的一步，对吧，关系到PBMC的得率

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-15 10:05

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强悍啊，谢谢分享经验

作者: shy8610 时间: 2012-8-15 11:07

回复突击兵之小土豆的帖子# ^; ]' G5 r9 G" \, [

本来想加你为好友的，可惜啊，刚入门权限不够，无法操作

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-8-15 11:21

回复 shy8610 的帖子& \/ H8 K% w+ n' x. `- ^! F( n

呵呵加你好友了

作者: shy8610 时间: 2012-8-16 10:33

本帖最后由 shy8610 于 2012-8-16 10:50 编辑 / ]8 Q/ F1 ?( N. E7 `/ X
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我无法回消息，留言，只有回帖的权限

作者: vanessa 时间: 2012-8-16 13:19

我们作为临床用的细胞，一般是沿壁吸的，吸取少量红细胞和血小板是没有关系的，因为它们会在后续的传代过程中被稀释。如果做科研用，可以沿中间吸，剩余少量淋巴细胞就不要了。

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