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标题: 关于mEB的悬浮诱导的几个问题 [打印本页]

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-18 17:26 标题: 关于mEB的悬浮诱导的几个问题

本人近期在做小鼠iPS的体外心肌细胞诱导，分别采用的悬滴和悬浮法，现有几个问题望大家解答：8 _7 n8 X& q5 |* ?% {* E6 a- z
4 x6 \1 X4 \$ }5 I0 _# B0 J
1.直接悬浮培养EB是iPS细胞悬液的细胞密度是多少？) O3 D2 Z& b/ q" h; l+ }$ _
2.悬浮后多长时间换液，期间是否需要使用摇床防止EB沉降和贴壁？
3.悬浮后多少天可以贴壁继续培养？
4.对于后面的心肌诱导而言，悬浮法和悬滴法得到的EB差别有多大？) t6 h4 W1 [3 [3 l5 Q1 {5 i

谢谢！

作者: wawj 时间: 2012-7-18 18:23

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我也是做这个的。希望你有好的结果，大家可以分享经验。
1.悬浮的话，细胞密度要到3*10^5.$ J$ O+ W$ Q! F
2.两三天换一次液，用摇床怎么用，放到孵箱里，太麻烦了吧。用那种国产的细菌培养皿，贴壁效果较差，就还可以。! [+ C6 V( C) `0 Z
3.一般悬浮5天后贴壁诱导分化。" O+ \6 ]& n( J
4.应该不大吧。只要形成好的ＥＢ，对后面的实验差别不大。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-19 01:40

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很感谢你的解答，今天是悬浮后D1，看了一下，EB已经形成，但感觉漂浮的细胞较多，且EB都是挤在一起的，EB边缘不圆滑，有死细胞，不知这是否是正常现象？我用的密度是1.2*10^5/ml，如果需要换液的话应该怎么换？半量换液还是重悬EB沉淀后换液？谢谢！

作者: frankieisme 时间: 2012-7-19 02:30

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收集细胞和培养液到离心管,操作台中静止30民,EBs自然沉降下来,去上清,再加新鲜培养液继续培养.

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-19 11:49

回复 frankieisme 的帖子9 u3 P* V. V6 R& U) u
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感谢，请问收集EB时应用什么器械收集，玻璃滴管或者1ml枪头？再就是收集到离心管中后是否需要轻轻吹打重悬，还是收集后直接等自然沉降30s？

作者: 刘森泉 时间: 2012-7-19 13:10

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问下你怎么将小鼠IPS转至地粘附培养皿的，我用胶原蛋白消化后，移液管刮下来放在地粘附六孔板，但团块都很小了。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-19 13:13

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我是用0.25%胰酶消化重悬再差速贴壁45min后吸出单iPS细胞悬液，按上面的密度直接加入到超低吸附版就行了。培养基是是20%FBS-高糖DMEM+NEAA+L-Glu

作者: 刘森泉 时间: 2012-7-19 13:17

回复 ligangtiancai 的帖子. T9 L0 |$ e' g5 N8 r
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谢谢！消化后是用移液管刮的还是吹的呢？还是消化至整个克隆脱离？

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-19 13:37

用玻璃滴管吹打就行，可消化3分钟后吹打30~50下然后加培养基终止后再吹打至单细胞

作者: frankieisme 时间: 2012-7-19 21:23

回复 ligangtiancai 的帖子0 {( p$ ~. ~; b& D0 F4 W2 y6 O$ p

移液管or1ml枪头都可以.

作者: ligangtiancai 时间: 2012-7-20 13:08

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恩我试了一下玻璃滴管没有问题！

作者: gexiaoyatou 时间: 2012-10-19 22:47

回复 wawj 的帖子: p+ c- I* ~% |9 c2 z
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我也是做IPS向心肌分化的，想问一下，最后的细胞老不跳会是怎么回事呢？有的还有大的黑点

作者: 第一心音 时间: 2012-10-20 00:17

我用悬滴培养 .悬浮的话，细胞密度要到20万吧.每天换液，放到孵箱里，贴壁之后赶快诱导。

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