干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: miRNA模拟物的转染体系与步骤 [打印本页]

作者: runsong 时间: 2011-7-31 19:15 标题: miRNA模拟物的转染体系与步骤

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

作者: runsong 时间: 2011-7-31 20:16

本帖最后由 runsong 于 2011-7-31 20:18 编辑
2 Z+ M$ b) s5 X1 z* l8 ^- O! H0 Z9 X
大家看能不能参照这个
siRNA 的转染（24 孔板为例）
I．准备细胞：
贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 6 w; \- S' f. \1 |% u
/ ~3 G/ J" E3 h. a6 D# Y
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： 8 e% S6 w  z! a- P, t
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 & t+ _! p" s: s2 ?
  混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3 - 5次混匀，室温下静置20 min。
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

作者: runsong 时间: 2011-8-12 12:36

自己顶。

作者: rain2402 时间: 2011-8-12 16:31

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

作者: 做个好孩子 时间: 2020-6-15 10:50

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。/ q: s0 v; v4 e
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。( K7 ~/ x, s( z7 N* s8 I
B. siRNA-RFect混合物准备：
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。6 F! x" Z$ ^# a) B* l: m
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。5 d. x: [, S) C. a& j6 @
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：2 [6 `+ d6 h O5 y/ ^- K
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。$ i7 `/ u1 N1 e
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

作者: runsong 时间: 2021-10-19 09:16

十年了

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://stemcell8.cn/)