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标题: 兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究 [打印本页]

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作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:38     标题: 兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

作者：张福勇，吴小涛，王运涛，鲍军平，朱磊，邱匀峰作者单位：东南大学附属中大医院 骨科,江苏 南京  210009
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          【摘要】  目的：初步探讨骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与纤维环（AF）细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响，进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法：分别培养兔的BMMSCs与AF细胞，将两种细胞按1∶1的比例混匀，利用离心管培养技术培养3周后取材，大体观察并行HE染色；使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖；通过实时荧光PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果：在体外培养3周后，细胞团体积达到最大，涂片染色显示共培养组细胞致密，细胞增殖较对照组明显，实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论：在离心管内三维培养条件下，BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖，增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。 ) f' A( T3 y) ?) c+ F
          【关键词】骨髓间充质干细胞； 纤维环细胞； 生物医学工程； 细胞培养； 兔0 B2 [7 v$ ]( X8 l( i+ s8 Z
                  下腰痛是一种常见的骨科疾患，发病率高，75%～80％的人在其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因，临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果，但并非针对椎间盘退变本身，目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退变［1］ 。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间盘有外层的纤维环（AF）、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复AF的完整性有着重要的意义［2］ 。本研究观察骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与AF细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。
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/ G/ \! A/ g5 k/ B4 y1材料与方法
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1.1实验仪器与材料4 H6 n/ X' G; T) {9 f9 Z
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实验仪器包括721分光光度计(上海市仪器厂)，高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，倒置荧光相差显微镜(德国Zeiss公司)，5%CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)，数码照相机(日本Canon公司)；实验材料有木瓜蛋白酶(E.Merck公司)，100%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶(美国 Sigma公司)，台盼蓝试剂(美国Sigma公司)，塑料离心管(Corning公司)，LG-DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、Hoechst33258和Calf Thymus DNA等试剂（Gibco公司）;新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR委托上海拓科生物技术有限公司检测。
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1.2实验步骤& U4 y& ^: n+ r  T/ P1 X5 x( |
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1.2.1取材1 H- y3 t: l: ~; P/ g1 \
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1.2.1.1BMMSCs的分离取1月龄新西兰大白兔30只,雌雄不拘,体重0.5～0.6 kg，1%戊巴比妥钠按2 ml·kg-1 的剂量施以全身麻醉，无菌操作下切取兔的股骨,两端剪断,用PBS液冲洗,收集细胞,离心后用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,然后于37 ℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液，以后每隔3 d换液1次，培养至第3代［3］。1 U$ p; }( c* P" t/ l2 R
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1.2.1.2AF细胞的分离取1月龄新西兰大白兔54只，雌雄不拘，体重0.5～0.6 kg，同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱，剔除周围软组织，取出椎间盘，放入含有PBS的培养皿内，用眼科剪去除终板及髓核组织，将AF的最外层及最内层去除，留取中间部分（图1），用PBS液冲洗3遍后，用眼科剪将组织剪成1 mm3大小，移入含有20 mlⅡ型胶原酶的培养皿内消化6～8 h，120目过滤器过滤后PBS液洗涤3遍，用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,置37 ℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液，以后每隔3 d换液1次，培养3周后待用［4］。
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图1终板及髓核被清除后的AF
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Fig 1AF after nucleus pulposus and endplate were removed
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" k, r8 h2 c" U- m3 G1.2.1.3共培养模型的建立及分组单层培养的细胞经胰酶消化后，按照每管含5105 BMMSCs、AF细胞或1∶1的比例混合细胞，将细胞悬液移入15 ml塑料离心管内，再加入DMEM培养液至5 ml，其中含10％的胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1链霉素，pH 7.4，以20g的离心力低速离心5 min形成微球，置于37 ℃、5％CO2、100％饱和湿度下培养，由此形成3个观察组，即BMMSCs组、AF细胞组和共培养组。5 d后第1次换液，以后每隔3 d进行半量换液，培养至第21天对各项指标进行检测［4］。6 ]% h4 i9 [( B
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1.2.2观察指标
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1.2.2.1组织学检查取离心管内培养的细胞团，大体观察并涂片、固定，然后行HE染色，观察细胞形态和组织结构。' q5 |" B% f, Z

- g  M8 h( M2 i( J% o: z+ a, R. e1.2.2.2DNA含量测定培养3周后，组织块用20 U·ml-1的木瓜蛋白酶消化过夜，采用Hoechst33258荧光法测定各离心管内细胞的DNA含量。20 μl标本中加1 μg·ml-1 的 Hoechst33258溶液2 ml，以牛胸腺DNA作为标准品绘制标准曲线，比较测定结果。
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  b. _- D$ b) B; l: o/ G1.2.2.3Ⅱ型胶原及蛋白多糖的PCR检测细胞培养3周后,以Trizol试剂裂解细胞。实时荧光PCR法检测mRNA表达：应用Cyber Green法，实时荧光PCR在MJ OPTICON 2定量PCR检测仪上进行，实验结果用OPTICON Monitor Analysis软件分析。所用引物序列均由上海生工生物工程公司合成。Ⅱ型胶原蛋白正义链GACCCCATGCAGTACATG,反义链 GACGGTCTTGCCCCACTT；蛋白聚糖正义链GAGGTCGTGAAAGGTGT,反义链GTGTGGATGGGGTACCTGAC。& E4 B$ M% P: _8 B9 p

2 j* f" E8 c0 b* x% a7 b1.3统计学处理
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结果采用SAS 8.1统计学软件分析，数据以x-±s表示。多组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。8 ?; p# B9 p6 p; ?7 j
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2结果
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! F3 N  V( s" @0 o2.1光镜及大体观察
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! s5 X; F  f- H% d5 w0 E7 w9 v( k, OAF细胞贴壁速度相当缓慢,5 d后开始有部分细胞贴壁，15 d后细胞贴壁数目不再增多，初始细胞呈圆形，后呈多角形、梭形或不规则形状,轮廓清楚,细胞核呈圆形，见图2。 细胞悬液经离心后，在离心管底部形成小的细胞团，直径约1 mm。3 d后细胞团的体积逐渐增大，BMMSCs组细胞团松散易碎，共培养组细胞团紧密不易吹散，AF细胞组居中。至第3周时，细胞团体积达到最大，共培养组细胞团可达到6 mm，BMMSCs组细胞团未见明显增大，AF细胞组细胞团体积略小于共培养组。
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2.2细胞形态学观察9 |$ f( k4 L" t% g2 A

* r6 O: i# ]6 u" L$ s至第3周时，HE染色观察细胞形态，AF细胞呈圆形或不规则形状，排列欠规整；BMMSCs呈椭圆形，排列稀疏欠规整；共培养组细胞呈圆形或不规则形状，细胞排列紧密，见图3。: k* N+ b4 s( u$ ]2 f

! i# u9 l5 o/ [' A9 i) {2.3DNA含量测定; \5 L% Z6 T% d% V/ B

# l2 u% n6 i% D$ ^在细胞接种后第1周，细胞DNA含量变化不明显；第2周时DNA含量共培养组迅速增加，AF细胞组稍增加，BMMSCs组减少；第3周时趋于稳定。共培养组DNA含量随时间延长而逐步增加，至第21天时明显高于BMMSCs及AF细胞组，差异有统计学意义（均P＜0.05,表 1）。 表1培养不同时间细胞DNA含量测定结果' l4 H3 e- b3 ^9 A; C) x4 ?
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2.4Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达
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( N- V) N, w1 Y) H体外培养3周的细胞经实时荧光PCR检测显示，共培养组细胞的Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达明显高于AF细胞组及BMMSCs组（均P＜0.01，表2），且AF细胞组的表达量明显高于BMMSCs组（均P＜0.05）。表2Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达(6 v6 ?! m. Q  b5 V* ^

: a/ ^. |) q2 i$ n: L6 n3 j* P3讨论% ^* o' j% M4 J: d, l
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椎间盘随着年龄的增加以及各种因素的影响而逐渐发生退行性变化。椎间盘退变的病理改变之一为AF的应力损伤,导致AF微断裂,使髓核突出。在椎间盘退变的早期，具有修复能力的AF细胞上调蛋白多糖和其它间质中的大分子，内部AF蛋白多糖含量的增加可在一定程度上弥补成人早期髓核蛋白多糖的下降［5］。退变晚期的椎间盘内细胞数量减少及功能受损，使得AF的自身修复能力下降，难以维持和修复自身的退变。此外椎间盘内细胞密度低，来源受限，使得通过简单的椎间盘细胞移植来修复AF存在困难。目前主要根据椎间盘退变的程度来决定修复策略，在退变晚期，椎间盘细胞代谢功能严重受损，已经不能够回应任何的生物学刺激，必须借助生物工程学以达到修复的目的。三维培养能够稳定椎间盘细胞的形状和结构，是维持细胞形态和表型所必需的。离心管培养是一种新而简单的培养椎间盘细胞的技术。这种三维培养只需要简单的离心，细胞团内相邻细胞间形成三维接触，有利于细胞外基质的合成［6］。分泌的细胞外基质使得细胞紧密地结合在一起，形成细胞与细胞间的接触，模拟椎间盘内的环境，有利于细胞团内的细胞维持天然的表型。细胞团在最初的2周内显著长大，3周后趋于稳定，达到最大尺寸。细胞团体积的增大是由于细胞外基质的合成及细胞的增殖，之后体积不再增大与通往细胞团中心的营养通道下降有关。9 Y# q+ `( U# ^
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BMMSCs具有以下特点：取材方便且对机体无害；由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题；它可以向多种组织类型分化，在体外可大量培养扩增；转入外源性基因后不影响其特性［3］。因此，BMMSCs成为骨组织工程理想的种子细胞，在治疗椎间盘退化方面取得了实质性的进展。本研究我们测试BMMSCs是否能够调整AF细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，是否可用于治疗或延缓椎间盘退变。髓核细胞在椎间盘退变过程中逐渐消失，因此在体内BMMSCs主要作用于AF细胞，而且获得大量有活性的髓核细胞相当困难，从而AF细胞成为修复椎间盘退变的靶向细胞［4］ 。椎间盘细胞与BMMSCs间及其细胞与细胞外基质间的相互作用机制尚不清楚，可能与细胞间缝隙连接及细胞因子等因素有关。Gruber等［7］证实了AF细胞间存在着缝隙连接，它的存在可以促进细胞的增殖及细胞外基质的分泌。Yamamoto等［8］证实了共培养模型中TGF-β1、IGF- 1、EGF、PDGF等含量明显增高，这些生长因子主要来自于BMMSCs，它们被证明可以促进椎间盘细胞的生长。& O5 n  h5 V! K: z3 R
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本研究中的离心管培养模型有利于BMMSCs与AF细胞间细胞因子的传递，有利于缝隙连接的形成，有利于细胞的增殖及细胞外基质的分泌，证明了体外共培养此两种细胞存在着可能性，且细胞团内的细胞维持着分泌细胞外蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力。本研究为进一步探索BMMSCs治疗椎间盘退变的可能性提供了证据。1 R  |- e$ v/ W( T2 o3 M2 y
          【参考文献】+ h. q8 C' ?. Q
［1］HOWARD S A,EUGENE J T,MASUDA K.Biological repair of intervertebral disc［J］.Spine,2003,28(15):S86- S92.2 h; i6 N: X3 `) f  y6 E0 w

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    ［3］赵梓汝,吴小涛,祁亚斌,等. TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2006,14(13):1019- 1022.
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    ［5］PETER J,ROUGHLEY L I,MELCHING T F,et al.The structure and degradation of aggrecan in human intervertebral disc［J］.Eur Spine J,2006,15 (Suppl 3):S326- S332." T' T8 M7 T$ g
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5 r1 Y9 D6 V7 @$ b5 X4 h1 [* c. Y    ［7］GRUBER H E,MA D F,HANLEY E N,et al.Morphologic and molecular evidence for gap junctions and connexin 43 and 45 expression in annulus fibrosus cells from the human intervertebral disc［J］.J Orthop Res,2001,19:985- 989.
0 Z, M5 A4 y, e7 q% P. ~. K0 r! Q, M2 J! ~1 r1 A, _2 H

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    ［8］YAMAMOTO Y,MOCHIDA J,SAKAI D,et al.Upregulation of the viability of nucleus pulposus cells by bone marrow-derived stromal cells［J］.Spine,2004,29(14):1508- 1514.

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作者: chenmay    时间: 2010-8-17 16:05

谢谢分享

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作者: 依旧随遇而安    时间: 2015-6-23 12:28

围观来了哦  

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作者: 123456zsz    时间: 2015-7-13 22:36

应该加分  

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作者: 杏花    时间: 2015-7-17 20:54

支持你加分  

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作者: 昕昕    时间: 2015-7-28 13:53

干细胞之家 我永远支持

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作者: dypnr    时间: 2015-8-17 09:54

我帮你 喝喝  

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作者: sky蓝    时间: 2015-8-23 13:41

今天无聊来逛逛  

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作者: nauticus    时间: 2015-8-28 07:27

表观遗传学

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作者: biobio    时间: 2015-9-2 21:33

羊水干细胞

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作者: 命运的宠儿    时间: 2015-10-18 14:54

免疫细胞治疗  

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作者: 杏花    时间: 2015-12-2 14:27

皮肤干细胞

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作者: 杏花    时间: 2016-1-22 10:54

看贴回复是好习惯  

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作者: 3344555    时间: 2016-2-25 21:34

挺好啊  

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作者: dglove    时间: 2016-3-6 11:10

干细胞分化技术

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作者: dd赤焰    时间: 2016-3-13 09:27

帮你顶，人还是厚道点好  

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作者: 狂奔的蜗牛    时间: 2016-3-20 12:01

不管你信不信，反正我信  

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作者: immail    时间: 2016-3-27 22:13

好啊，，不错、、、、  

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作者: 再来一天    时间: 2016-5-17 18:15

就为赚分嘛  

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作者: 碧湖冷月    时间: 2016-5-19 21:18

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界 。。。。。。。。。  

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作者: xiaomage    时间: 2016-5-30 17:33

家财万贯还得回很多贴哦  

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作者: keanuc    时间: 2016-8-3 14:54

不管你信不信，反正我信  

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作者: 初夏洒脱    时间: 2016-8-6 22:51

不错，支持下  

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作者: 舒思    时间: 2016-8-11 04:47

我想要`~  

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作者: 追风    时间: 2016-9-30 08:10

好啊，，不错、、、、  

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作者: tian2006    时间: 2016-11-7 16:27

好人一个  

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作者: 苹果天堂    时间: 2016-12-2 16:26

做对的事情比把事情做对重要。  

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作者: 橙味绿茶    时间: 2016-12-6 17:01

间充质干细胞

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作者: 草长莺飞    时间: 2016-12-7 10:54

原来这样也可以  

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作者: myylove    时间: 2016-12-26 09:01

努力~~各位。。。  

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作者: 蝶澈    时间: 2016-12-28 10:01

慢慢来，呵呵  

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作者: 命运的宠儿    时间: 2017-1-10 09:27

我想要`~  

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作者: DAIMAND    时间: 2017-2-4 23:19

人气还要再提高  

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作者: myylove    时间: 2017-2-10 14:10

肌源性干细胞

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作者: 水木清华    时间: 2017-3-2 23:54

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。  

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作者: 天蓝色    时间: 2017-4-13 19:02

顶顶更健康，越顶吃的越香。  

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作者: renee    时间: 2017-4-13 21:16

支持一下吧  

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作者: ringsing    时间: 2017-4-14 22:27

回贴赚学识，不错了  

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作者: dreamenjoyer    时间: 2017-5-24 18:29

真是佩服得六体投地啊  

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作者: cjms    时间: 2017-6-27 03:31

每天早上起床都要看一遍“福布斯”富翁排行榜，如果上面没有我的名字，我就去上班……  

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作者: 分子工程师    时间: 2017-7-13 18:01

加油啊！偶一定会追随你左右，偶坚定此贴必然会起到抛砖引玉的作用~  

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作者: dataeook    时间: 2017-7-21 00:16

这样的贴子，不顶说不过去啊  

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作者: 3344555    时间: 2017-7-23 14:35

这个站不错！！  

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作者: 小小C    时间: 2017-8-1 21:07

转基因动物

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作者: heart10    时间: 2017-8-2 08:34

不错!  

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作者: DAIMAND    时间: 2017-8-3 03:27

我的啦嘿嘿  

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作者: 糊涂小蜗牛    时间: 2017-8-6 23:53

昨晚多几分钟的准备，今天少几小时的麻烦。  

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作者: 碧湖冷月    时间: 2017-8-9 10:18

慢慢来，呵呵  

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作者: 求索迷茫    时间: 2017-8-15 03:31

人之所以能，是相信能。  

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作者: 再来一天    时间: 2017-8-23 18:35

免疫细胞治疗  

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作者: Whole    时间: 2017-8-31 03:27

天啊. 很好的资源

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作者: ladybird    时间: 2017-9-17 13:43

努力~~各位。。。  

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作者: abc987    时间: 2017-9-20 21:07

楼主，支持！  

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作者: awen    时间: 2017-10-9 00:57

来几句吧  

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作者: 丸子    时间: 2017-10-21 01:02

不错 不错  比我强多了  

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作者: Kuo    时间: 2017-10-27 14:54

应该加分  

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作者: www1202000    时间: 2017-10-29 09:43

越办越好~~~~~~~~~`  

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作者: 小敏    时间: 2017-11-16 08:43

干细胞产业是朝阳产业

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作者: pengzy    时间: 2017-11-16 18:06

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。  

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作者: 知足常乐    时间: 2017-11-26 13:10

呵呵 大家好奇嘛 来观看下~~~~  

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作者: dglove    时间: 2017-11-28 00:34

不知道说些什么  

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作者: dongmei    时间: 2017-12-14 04:21

宁愿选择放弃，不要放弃选择。  

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作者: na602    时间: 2017-12-18 12:34

楼上的稍等啦  

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作者: xuguofeng    时间: 2018-1-1 05:16

加油啊！！！！顶哦!!!!!  

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作者: chongchong    时间: 2018-1-2 14:35

貌似我真的很笨????哎  

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作者: SCISCI    时间: 2018-1-11 20:18

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。  

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作者: tempo    时间: 2018-1-19 04:22

好帖，有才  

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作者: 知足常乐    时间: 2018-1-25 05:35

今天无聊来逛逛  

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作者: 一个平凡人    时间: 2018-2-16 06:04

(*^__^*) 嘻嘻……  

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作者: ringsing    时间: 2018-2-24 05:05

原来是这样  

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作者: 化药所    时间: 2018-2-25 14:10

今天再看下  

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作者: chongchong    时间: 2018-3-25 00:27

干细胞与动物克隆

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作者: foxok    时间: 2018-4-10 13:10

就为赚分嘛  

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作者: 生物小菜鸟    时间: 2018-4-11 19:35

感觉好像在哪里看过了，汗~  

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作者: 分子工程师    时间: 2018-5-1 19:16

我仅代表干细胞之家论坛前来支持，感谢楼主！  

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作者: nosoho    时间: 2018-5-9 09:18

干细胞疾病模型

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作者: 大小年    时间: 2018-5-24 10:35

既然来了，就留个脚印  

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作者: 老农爱科学    时间: 2018-5-26 01:15

既然来了，就留个脚印  

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作者: 草长莺飞    时间: 2018-6-5 15:53

发贴看看自己积分  

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作者: whyboy    时间: 2018-6-29 12:25

不错 不错  比我强多了  

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作者: 123456zsz    时间: 2018-7-11 22:17

老大,我好崇拜你哟  

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作者: dd赤焰    时间: 2018-7-13 00:53

今天临床的资料更新很多呀

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作者: xiaomage    时间: 2018-7-24 03:31

我等你哟!  

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作者: leeking    时间: 2018-8-2 14:17

这样的贴子，不顶说不过去啊  

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作者: 狂奔的蜗牛    时间: 2018-9-1 15:27

在线等在线等  

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作者: lalala    时间: 2018-9-16 15:14

支持一下  

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作者: 再来一天    时间: 2018-10-4 12:59

谁都不容易啊 ~~  

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作者: 蝶澈    时间: 2018-10-10 20:05

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。  

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作者: 快乐小郎    时间: 2018-10-14 14:25

这个贴不错！！！！！  

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作者: lab2010    时间: 2018-10-15 02:10

看贴回复是好习惯  

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作者: qibaobao    时间: 2018-11-1 16:00

干细胞研究非常有前途

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作者: dreamenjoyer    时间: 2018-11-16 20:35

不错不错.,..我喜欢  

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作者: 加菲猫    时间: 2018-11-17 09:01

肌源性干细胞

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作者: tian2006    时间: 2018-11-30 07:09

留个脚印```````  

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作者: xm19    时间: 2018-12-7 20:26

哈哈 瞧你说的~~~  

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作者: 王者之道    时间: 2018-12-8 06:14

在线等在线等  

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作者: aliyun    时间: 2018-12-14 04:46

ding   支持  

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作者: 咖啡功夫猫    时间: 2018-12-24 18:59

希望可以用些时间了~````  

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作者: cjms    时间: 2018-12-28 05:14

好贴坏贴，一眼就看出去  

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作者: 橙味绿茶    时间: 2018-12-28 09:54

我仅代表干细胞之家论坛前来支持，感谢楼主！  

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