: ]9 X7 ?1 y9 y1 I2 O7 y Z H A O Jian ， W A N G Ying ， W A N G Guang2li，C H E Hui，K O N G Xiang2rong ，LIU Xiao2cheng . B3 r: |) t: ~- G! _9 O1 y0 ?+ H - I" d1 Y. V. p5 @; Y0 dChinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation M edicine ，2007 ，16 （4 ）：321( Z: p( L) ~+ N3 i' I% ^
/ i6 M9 I! p6 ~' d' \" ~' ZAbstract：Objective ：To investigate the effects ofintramyocardialinjecting bone marrow mesenchy mal stem cells com2 bined with fibrin sealant in cells transplantation .M ethods ：（1 ）Prepared for isolation ，purification ，culture ，expan2 sion of bone marrow M SCs1 （2 ）Mini2swine were randomly assigned to establish models of acute myocardialinfarction and then were performed by the subsequent procedure ：intramyocardial M SCs injection alone（Group M SCs ）and in2 tramyocardial M SCs injection com bined with FS （Group M SCs FS ）.Six weeks postoperatively ，quantitative analysis of fluorescent2labeled cells was performed by Image Pro Plus 415 software .Likewisely ，neovascularization by histo2 chemically staining was analyzed as well.Cardiac function was assessed by echocardiorgaphy .Results ：Six weeks postoperatively ，both the retention nu m ber of positively labeled cells and new vessels density in Group M SCs FS showed significant increase com pared with those in Group M SCs （P ＜ 0101 ）.M yocardial function of EF % and FS %in Group M SCs FS markedly im proved co m pared with that in Group M SCs （ P ＜ 0105 ，＜ 0101 ）.Conclusion ：In2 tramyocardialinjecting bone marrow M CSs co m bined with fibrin sealant can increase the retention oftransplanted cells ，pro mote neovascularization formation and enhance myocardial systolic function . / k5 y6 b2 l: o1 E" Y$ j9 Y' p, Q$ G1 c$ n1 n! {: f" m% k
Author′s address ：Department of Cardiovascular Surgery ，T E D A International Cardiovascular H ospital，C A M S and P U M C ，Tianjin ，300457 ，China ; g- L. J% b l5 \4 j+ k / |- X; X5 u0 l5 M# ^7 d& ^Key words ：M yocardialinfarction ；Transplantation ，stem cell；Ventricular function : r) |9 D$ N9 ?1 Y, N/ Z9 h/ @, u. `6 f! c5 A9 W" Y6 t+ E
20 世纪80 年代兴起的搭桥、冠脉介入术挽救了大量冠心病患者的生命，然而10 年生存期后，桥血管或者血管内支架再狭窄的问题又困扰着人们。 ' F& A5 b1 A2 Q7 \2 k5 a J2 I/ @. n% I" e3 i
上述患者的12 %［1 ］由于冠脉血管弥漫性病变或缺乏桥血管而单纯借助C A B G 和PCI 方式已难以达到完全血运重建。当前，作为C A B G 术中辅助治疗方式—骨髓间充质干细胞心肌点状注射疗法，正尝试从细胞水平重建侧支微循环，改善血流灌注。本研究探讨心肌注射骨髓间充质干细胞（M SCs ），联合应用纤维蛋白封闭剂（FS ）对细胞滞留量的影响。 # C1 z; E" i+ i 6 o7 f# J+ N% C+ x. Q3 R0 m2 a, n- `1 资料与方法2 X) d) _' X" Z9 @" v/ B: G4 O
v* Q' i: B" H' n1.1 骨髓M SCs 的分离、培养、扩增及标记中国实验用小型猪（购自北京琉璃科兴实验动物养殖中心），雌雄不拘，体重15 ， 18kg 。无菌条件下18 号骨髓穿刺针接20 ml 注射器，内含肝素6 000 U 。% Z6 o9 Y& ^4 F Q8 _, { S. m2 l
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于髂后上棘多点抽取骨髓液共约25 ml，以等体积生理盐水稀释，Percoll（11073g／cm 3 ）密度梯度离心法分离单个核细胞。1 500 r／min 离心20 min ，取白膜层细胞，以生理盐水洗涤，1 200 r／min 离心10 min 。0 q5 a: p" S/ h1 R4 y1 u
% I; G L2 s* R2 C2 Z随后以210 105 个／cm 2 密度接种于培养瓶中。在5 %C O 2 、37 ℃饱和湿度的孵箱内培养。培养液的成分为：40 % M C D B 201 培养基、50 % D M E M ／F12 、2 %胎牛血清、100 U／ml 的青霉素和链霉素。第3 d 去除悬浮细胞，而贴壁细胞继续培养至10 d 左右，每3 d换一次液。当细胞融合至约80 %时，用0125 %的胰蛋白酶消化1 ∶3 传代。 * B( d: a. [ ], o. f9 Q+ j% l8 q" ]+ y
细胞染料C M -DiI 购于美国Sig ma 公司。用二甲基亚砜溶解DiI 结晶颗粒，配成1 m m ol／L DiI 的溶液，密闭避光保存于-20 ℃。每毫升细胞悬液加2μl DiI 溶液，轻柔混匀，置于37 ℃恒温箱中孵育5min ，然后立即于4 ℃ 环境中静置15 min ， 进行标记。将标记好的细胞悬液以1000 r／min 离心10 min ，37 ℃预温的PBS 溶液洗涤3 次，1 ml 生理盐水重悬标记细胞，移植备用。台盼蓝染色评价细胞活力。 Z0 T/ Q$ z* s. |( G
; T4 Y9 T8 Q9 I9 C) B3 [
1.2 动物模型及操作$ t' M0 A( F+ K6 K
! h5 O5 {: p( p+ U. D! K* T W10 只中国实验用小型猪（ 同上）， 雌雄不拘，体重25 ， 35kg 。根据心外膜是否加用纤维蛋白封闭剂（广州倍秀生物技术有限公司）将其随机均分为：单纯M SCs 心肌注射组（M SCs 组） 和M SCs 心肌注射联合FS 组（M SCs FS 组）。具体实验操作如下：小型猪肌肉注射氯胺酮（10 m g／kg ）、咪唑安定（012 m g／kg ）诱导麻醉， 术中1 ， 2 %异氟醚吸入、氯胺酮（20μg／min ·kg ） 静点维持麻醉。气管插管，呼吸机吸入氧流量1L／min 。胸骨正中切口，明确冠脉前降支走行，于其中、远端1／3 交界处阻断，反复缺血预适应3 次后彻底结扎。配备27Gauge 针头的注射器，抽取总量为2 107 的细胞悬液1 ml，于结扎血管支配部位心肌垂直进针4 ， 5 m m ， 回抽无血后注射，分10 点注射。M SCs 组细胞悬液注射完毕后常规关胸，M SCs FS 组每点注射完拔针后，助手即刻将纤维蛋白胶滴于心外膜针口，余处理无差别，术后均肌注青霉素320 万U ，2 次／d ，3 d 。5 J8 g) n: @' j5 r) k( ~
* F. T) E; i) B4 T: R
1.3 心功能的超声学评价 . M* Q# J \2 K# d+ H( \" W% n ; v* }& O; S$ q3 q2 Y图像采集应用Philips Sonos 7500 超声心动图仪，S3 探头频率为1.6 ， 312 M Hz ，同步记录心电图。分别于心尖两腔、四腔、左心室长短轴切面采集资料存盘。脱机测量左室终末舒张期内径（L V E Dd ）、左室终末收缩期内径（L V E Ds ）、左室短轴缩短率（FS %）及以双平面Sim pson 法计算左室射血分数（EF %）。为避免猪较厚的皮下脂肪及拱形前突的胸骨的影响，采用开胸状态直接采集各切面图像，心内膜显示清晰；同时为避免声束近场图像的丢失，保持切面的完整性，在超声探头与心外膜间放置无菌水囊。 1 U: N+ q2 F, ]/ B" c5 |: C 5 f q9 N* n/ [0 t# e+ F1.4 荧光标记细胞的量化 : C3 v! i7 M! s% p* D- p, U$ b5 |, Z" e4 O, ~: p/ A
超声学图像采集结束后静脉推注10 %K Cl，使心脏停搏于舒张期， 心尖部位随机获取组织样本，4 %甲醛固定24h ， 常规脱水、浸蜡、包埋， 切片5μ m ，在激发光波长553n m 荧光显微镜下（Oly m2pus B X51 ，日本）观察，在放大倍率、曝光时间均相同的条件下，随机采集非重叠视野图像并转化为 Tiff 格式保存，经图像分析软件Image Pro Plus 415（IPP ， M edia Cybernetics ， M aryland ， 美国） 处理，光密度（O D ）校正后进行量化比较。) {9 q7 L. O x) A) C
' Q) K, }8 `% i- y4 v% b& L8 {9 [1.5 免疫组织化学染色和血管计数0 \7 H1 d# \% }! k- ]/ H: p3 E
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组织切片常规行H E 染色；免疫组织化学染色切片以体积分数3 %的H 2 O 2 阻断，正常羊血清封闭，加入兔抗人Ⅷ 因子相关抗原多克隆抗体（Dako 公司，丹麦），4 ℃过夜，次日加入二抗，D A B 显色，苏木素复染。血管计数方法：每组取10 个标本，首先在荧光显微镜下证实为细胞移植区后，再连续切片完成上述免疫组化染色步骤；然后每张切片随机采集非重叠视野，每组共采集50 个视野，IPP 量化分析同上。 ; ^8 v+ r i5 U' v& f( t, d9 }9 k$ f7 R! ^7 ^9 y) B! s
1.6 统计学方法6 _) a* ?8 Q( L
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实验数据以均数±标准差（珚x ±s）表示，应用SPSS 1310 统计学软件分析，两组间数据比较采用独立样本t 检验，P ＜ 0105 为差异有显著性。 0 e3 }5 C6 F' V3 O2 ?. p/ n: b2 N# h
2 结 果 2 F& C. V) p7 ` ( N2 F/ X% j8 S" }3 `2.1 动物存活评价 # @9 H& ~) n. ~& B; L3 u2 K6 Y$ d 9 c; W3 O3 M5 [! e O: H6 M共计19 只小型猪用于复制急性心肌梗塞模型，术中3 只发生室颤，直接心表电复律后仍反复发作，未进入实验分组；共16 只，每组各8 只完成整个细胞移植操作。 6 d; z! i8 [4 a1 _7 S7 ~; |. S, H5 T6 l0 n
2.2 移植操作评价7 b! \) K1 _7 o3 L. ~5 ~! {
+ |8 a+ U: c: z0 i$ F6 H骨髓M SCs 经C M -DiI 染色后，荧光显微镜下观察标记效率接近100 %，台盼蓝染色细胞活力＞95 %。心肌注射部位呈暗紫色，进针深度控制在4， 5 m m ， 过深可注入心腔丢失， 每点注射量约011 ml，过多易导致局部心肌水肿， 增加局部组织 张力，使细胞自心外膜过多渗漏。M SCs 组拔针后可见细胞从心外膜针口处随心肌收缩持续渗出，而M SCs FS 组点滴纤维蛋白封闭剂后4 ， 5 秒即在心外膜凝固成膜，阻抑细胞渗出。操作中偶有室性早搏出现，无严重出血、栓塞事件发生。 . H O T' i- {, N6 ] 4 @* S9 n6 L, Y: p8 I- g2.3 超声学评价: d/ P% v1 q$ x2 b: h# A
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结扎血管支配部位心肌运动明显减弱，两组移植前各超声学指标无显著差异（P ＞ 0105 ）。移植后6 周，M SCs FS 组与M SCs 组L V E Dd 、L V E Ds存在显著差别（ P ＜ 0101 ）， 心肌收缩功能指标FS %、EF %在M SCs FS 组较M SCs 组显著提高，见表1 。: B9 `' |8 q0 @5 z
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2.4 荧光阳性细胞及新生血管密度量化分析" h+ E) G* {: f1 Q& i' S) n
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在曝光强度（30 ms ）、放大倍率（40 ） 一致的前提下，各组随机采集图像，经O D 校正后将荧光阳性区域单色选定， 转化为像素（Pixels ） 表示（图1 ， 2 ，见封三）。其中M SCs FS 组移植细胞呈片状聚集，光密度（71517 ±9916 ）像素，M SCs 组细胞散在分布， 走形似针头注射方向， 光密度（57013 ±101.6 ）像素，两组间存在显著统计学差异（F =01003 ，P ＜ 0101 ）。连续切片分析视野内血管密度方法同上（图3 ， 5 ， 见封三），M SCs FS 组（653218 ±55217 像素） 较M SCs 组（578815 ±54113 像素）显著增加（F =01382 ， P ＜ 0101 ），并且管腔较大，呈网状交织。" @# v$ u2 L+ q7 l/ G* l
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3 讨 论 4 u. g5 l/ d& J) C. @- ]* E" x1 N0 N9 d' \( r" F6 w; i
目前，骨髓M SCs 治疗冠心病的临床试验主要通过冠脉介入和心肌注射途径开展。前者创伤小，易接受，但注射后细胞绝大部分滞留于肺、肝、脾等器官，仅少量寄居在心肌间质；而后者虽需开胸操作，创伤大，但随着肋间小切口配合胸腔镜等微创技术的不断完善，将会克服创伤大的弊端，并且，该移植路径具有术野清晰直观，作用部位明确，目的器官滞留率高等优点。但是，心肌作为特殊的泵收缩器官，势必挤压细胞导致其自心外膜口渗漏丢失。Teng 等［2 ］向小型猪心肌壁注射直径10μ m 的荧 2 E# S! c+ j$ ?9 J # H8 h* I6 i0 J+ n% r光微球，量化比较了心脏跳动与否对其残留率的影响，非跳动心脏残存率为6714 %，而跳动心脏注射后液体即从心脏表面针道口漏出，其实际有效残存率减少为1111 %。类似的现象也在Dow 等［3 ］细胞心肌注射实验中证实， 注射10 min 后仅4418 %的细胞滞留在心肌，这一看似细微的现象使细胞注射剂量与实际心肌滞留量之间存在很大差异，这也可能是导致各个实验室之间结果差别的原因之一。国内［4 ］采用大鼠心外膜缝线打结的方法闭合针道外口，以减少细胞丢失。但是，在更贴切反映临床疗效的# H; i- N5 [+ I2 O) @6 `' } o
: N1 u1 D2 E9 n' }9 w* S大型动物实验中，心肌至少需8 ， 10 点注射，而在不停跳状态下过多的心外膜浅层缝线势必导致手术繁琐，并且会造成额外的心肌损伤。本实验采用的纤维蛋白封闭剂提前混溶，注射拔针后心外膜点滴少许，对心肌无任何刺激，封闭效果明确，术中直视观察及术后组织学量化分析均证实该改进能够显著增加心肌内移植细胞的滞留量，进而促进微血管再生，改善血流灌注，为提高注射骨髓M SCs 的效果提供了新的途径，为各实验室及临床研究提供可比性方法。 R* z* O; y, j, f' ?( m. U2 |0 }2 \' X( }1 S
本实验采用密度梯度离心法和贴壁培养法联合分离纯化得到骨髓M SCs［5 ］。在体外培养扩增传代过程中，需要考虑的一个重要问题是合适的细胞密度［6 ］。同样道理，当细胞从体外培养液移植到体内组织间隙时，稳定局部的细胞密度也至关重要。本实验联合应用的针道外口封闭剂， 由纤维蛋白原、凝血因子Ⅻ 、凝血酶、氯化钙等组成，已经广泛应用于脏器裂口粘合和组织创面封闭等领域，通过模拟人体自身凝血反应，形成具有良好弹性和稳定性的膜状纤维蛋白多聚体，牢固的粘合在心外膜表面，封闭针道外口创面，维持细胞密度恒定，为其向内皮细胞分化提供适宜微环境（niche ）［7 ］。并且该蛋白制剂无细胞毒性［8 ］，对实验组M SCs 不产生影响。" B3 \, A1 ^# K/ Y
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IPP 软件能够准确的分析图片中某一特殊染色区域的面积，在指标量化方面具有独特优越性［9 ］，特别是在血管计数方面。传统的方法是随机行高倍视野人工计数，一方面可能增加人为误差，另一方面，当血管直径差别较大时（图3 、图5 ，见封三），其改善心肌灌注的能力是不同的，若将管径大小不一的血管均单一计数，显然是不合理的。而IPP 软件则排除以上干扰，以血管壁阳性着色面积进行量化分析，能够准确比较区域内整体血管密度。但是，在IPP 软件应用中，应当特别注意各组放大倍数和曝光时间的一致性，并且病理切片在染色过程中条件应相同，避免着色深浅对结果产生偏差。 / T' {* u3 p A O$ G 【参考文献】 b8 f& b* c- I* l［1 ］M ukherjee D ，Bhatt D L ，Roe M T ，et al.Direct myocardial re2 vascularization and angiogenesis2how many patients might be eli2 gible ？［J ］.A m J Cardiol，1999 ，84 ：598 -600 . 6 c# o! e$ v* D, T& h3 D8 i$ V; `! U! T- ^8 x$ J. ]& ]
" H# [, [- B2 x) h. Q$ Z0 Q
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［2 ］Teng CJ ，Luo J ，Chiu RJ ，et al.M assive mechanicalloss of mi2 crospheres with direct intramyocardial injection in the beating heart ：im plications for cellular cardiom yoplasty ［J ］.J Thorac8 U6 r1 r6 a) S: ]- `