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标题: 复合bFGF缓释支架结合骨髓间充质干细胞移植对心梗后血管新生的研究 [打印本页]
作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:24     标题: 复合bFGF缓释支架结合骨髓间充质干细胞移植对心梗后血管新生的研究

作者：王颖，赵建，孔祥荣，刘晓程作者单位：北京协和医学院泰达国际心血管病医院，天津市  300457
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; I, D2 D+ T# |          【摘要】  目的：探讨心肌机械钻孔结合复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的缓释支架及骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对心肌血运重建的作用。方法：建立猪急性心梗模型后，于缺血区进行直径3.0 mm的透壁性钻孔再生血管术（drilling transmyocardial revascularization, TMDR）并置入等直径的缓释支架，在孔道周围分五点进行细胞移植。心梗模型建立后0.5 h及术后6周行心肌核素显像检测。取术后6周的心肌标本进行病理组织学检测。结果：术后6周，与对照组相比，治疗组的新生血管密度及心肌局部血流灌注均显著增加（P
4 }8 Z" P8 v) C0 h- y          【关键词】心肌梗死；支架；干细胞移植$ T: d$ h6 l$ ]9 v& m5 B
                  基金项目：天津市科技发展计划项目（05YFGZSF02900）/ L' [6 l. }2 ]; S* m8 |
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　　Experimental study of slow-release stent of bFGF and bone marrow stem cells implantation in myocardial infarction/WANG Ying, ZHAO Jian, KONG Xiang-rong, LIU Xiao-cheng//1 f+ y4 l5 T9 i6 X& h+ O! c

$ u' G: D1 Y9 w& f$ F0 y7 E5 ?　　Author′s　address：Department of Cardiovascular Surgery, TEDA International Cardiovascular Hospital, Peking Union MedicalCollege, Tianjin, 300457, China: K( T9 z' d7 g4 [: n/ x
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+ w  z+ M- s& K% l; S0 O  s　　Abstract：Objective:To investigate the effects ofdrilling transmyocardial revascularization（TMDR） with slow-release stent of bFGF and bone marrow derived stem cell(BMSCs) transplantation on myocardium revascularization.Methods:Mini-swine was randomly assigned to establish models of acute myocardial infarction, subsequently received TMDR,stent implantationand cells transplantationin the infarction territory.Six weeks postoperatively,pathologic histology analysis was performed.Results:Six weeks post operatively vascular density was significantly improved in treated groups compared with control group(P, z' F; f+ m# L' w

$ N# r+ c  `5 V' o& s$ }, {　　Key words：Myocardial infarction;Stent;Stem cells transplantation% Y! Q7 M& V; n7 u, N: [

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! Z! y$ n2 c( w. j6 y; ]& g　　骨髓间充质干细胞（BMSCs）由于其促进心功能和逆转心室重构等作用已被广泛应用于缺血性心脏病的治疗［1］。近年来外源性蛋白因子促进血管新生可能成为一种有效的办法。实验证明： 复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及透壁性钻孔再生血管术（TMDR）具有很强的促血管新生作用［2，3］。因此，我们采用了多种促进心肌血管生成和血运重建的方式，即通过在TMDR孔道中置入蛋白缓释支架并在支架周围进行BMSCs移植，检测这种协同作用的效果，旨在寻找一种更为有效的治疗缺血性心脏病的手段。; S0 W( _( S' ?
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　　1资料与方法) K' V3 Q2 S% h0 _$ |
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　　1.1BMSCs 的分离、培养、扩增及免疫表型检测& e2 n, D, L) v4 Y

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% G% A! l7 C" y# _) a　　中华实验用小型猪，雌雄不拘，体重15～18kg。无菌条件下利用18号骨髓穿刺针接以含6 000 U肝素的注射器从髂后上棘抽取骨髓液约25 ml。采用密度梯度离心法分离BMSCs。具体步骤如下：将细胞稀释液加于1.077g/ ml的Ficoll试剂上，1 500 r/min，离心20 min。将离心后的白膜层用D-Hanks溶液洗涤后，将细胞悬浮于细胞培养液中，置于含5% CO2，37%湿度的培养箱内。培养液的成分为：40% MCDB201、50% DMEM/ F12培养基、2%胎牛血清、100 U/ml的青霉素和链霉素。培养后48 h，除去悬浮细胞并每隔3 d进行换液，至汇合度达80%。移植前以0.25%的胰酶收获细胞。) Y3 g7 g1 v& T

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　　免疫表型检测：用磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞2次，重悬细胞并加入抗人CD34, Flk1, CD44, CD31, CD29, CD105、CD106 一抗（Santa Cruz公司，美国）4℃孵育30 min，PBS充分洗涤后加入FITC标记的荧光二抗4℃孵育30 min。对于细胞内抗原Flk1的检测，在抗体孵育前预先使用2%多聚甲醛4℃固定15 min，0.1%皂角素室温透化1 h。实验中，我们采用同种属，同免疫表型的相关抗体作为同型对照。细胞洗涤后，重悬于PBS中进行流式细胞仪检测。
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' `( O" V% p- C9 d4 N7 @/ c, S  F　　1.2体外细胞标记1 _! a3 W2 I' G3 @/ {: H5 L
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　　红光荧光细胞染料CM-Dil购于美国Sigma公司。预先用DMSO溶解。按每ml细胞悬液加2μl Dil染料溶液（共2107细胞），混匀后置于37℃恒温箱中孵育5min，然后于4℃环境中静置15min。将标记好的细胞悬液以1 000 r/min离心10min，37℃预温的PBS溶液洗涤3次, 1 ml生理盐水重悬标记细胞备用。荧光显微镜观察细胞的体外标记效率在95%以上。- M7 F% D6 h) u3 ~  D+ g/ q

0 `* T8 @" }! Z/ @　　1.3复合bFGF的肝素化缓释抗凝支架的准备& a# M. f. N! d* p; W. |
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　　采用高分子材料PLGA研制的新型肝素化可降解缓释支架。聚已内酯（polycaprolactone, PCL）作为支架的承重层，50∶50 PLGA作为bFGF缓释载体层，通过高温熔融挤塑、表面喷涂等工艺制备外径3.0mm，内径2.8mm的同心管状支架。以微钻头对支架侧壁进行阵列式打孔以增加侧壁血流灌注及药物渗透。每个管状支架含bFGF（R & D公司，美国）10μg、肝素（鼎国生物科技公司，中国）25mg。60钴（Co）消毒，4℃储存。
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　　1.4心梗模型制作
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- f& \8 Q" B) _" `　　中华实验用小型猪(同上)，雌雄不拘，体重25～35kg。肌肉注射氯胺酮(10mg/ kg)、咪唑安定(0.12mg/ kg)诱导麻醉,氯胺酮(20μg/ min ·kg) 静点维持麻醉。胸骨正中切口，于冠脉前降支中、远端1/ 3 交界处阻断，缺血预适应3次后彻底结扎。术后均肌注青霉素320万U, 2 次/d, 3 d。
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; Y& h7 P3 J3 ?　　1.5支架置入及细胞移植
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　　心梗模型建立后，利用中空钻头在心梗区进行高速透壁型机械式钻孔，转速为13 000 r/min。钻孔后立即置入支架并将其末端接扎固定于心外膜。支架置入后，用微量注射器将预先备好的1 ml细胞悬液分五点注射入支架周围心肌，随即滴加纤维蛋白胶以封闭心外膜针孔。实验动物被随机分为4组：单纯打孔结合生理盐水注射组（T，n=6），打孔后支架置入组（TS，n=6），打孔后干细胞移植组（TC，n=6)，支架置入结合干细胞移植组（TSC，n=6）。. [9 |6 I6 V  k

& [2 K) h/ ^: f2 ]　　1.6免疫组化及新生血管量化分析
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　　术后6周，麻醉实验动物，静脉推注100g/L KCl，使心脏停搏于舒张期。分离心脏，在支架或孔道周围取组织样品并固定于10%的福尔马林溶液中。将包埋后的组织制成4μm的切片。组织切片常规行HE染色。免疫组织化学染色以3%的H2O2阻断, 正常羊血清封闭, 加入兔抗人vWF多克隆抗体(Dako公司, 丹麦), 4℃过夜, 次日加入二抗, DAB显色, 苏木素复染。血管计数方法：在放大倍率、曝光时间均相同的条件下，每组取10个标本，每张切片随机采集非重叠视野，每组共采集50个视野图像。经图像分析软件Image Pro Plus 4.5（IPP, Media Cybernetics, 美国）处理，光密度（Optical Density，OD）校正后进行量化分析［4］。
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6 V% ?( Z0 X9 e" t2 c: }& F: a　　1.7移植细胞鉴定2 F3 }' |) E5 |8 R) |

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　　将镜下发出红色荧光的切片进行免疫荧光检测：利用vWF抗体、平滑肌肌动蛋白抗体(Dako公司，丹麦)及心肌肌凝蛋白重链抗体（Abcam公司，英国）作为一抗，FITC标记的二抗孵育后直接置于镜下观察，检测其体内分化情况。% O, C$ e4 ~& Q$ U, n

) V, {) a( t# w9 p# h　　1.8统计学分析
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; S, X: g$ ~' e$ O( g1 J! k, A　　利用SPSS 13.0版统计学软件进行数据分析，并以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析进行组间比较，P& V9 [/ ?5 h+ D" ~. L4 Z% V3 S& a  f

) c. q1 g% c, c! w6 @
0 Z. }. g. r$ w+ [( s: M" E
% u9 i+ I9 W3 V: a, Y　　2结果
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0 h5 A! \7 S8 d$ l) x' u' t" v　　2.1培养细胞的形态及免疫表型测定( K0 P' K2 `1 U1 H9 x2 U
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8 c; @1 ^. U% p* M% V) u- G1 B" Y; T
5 B1 {. Z7 T: _  T: a　　培养后7 d，细胞呈较大的扁平样或纺锤样。流式细胞仪分析得到：细胞不表达造血细胞标志CD34、CD45及CD31，而Flk1的阳性率却在60%左右。1 i" D( |+ L1 Y. ~# `; G: c2 ]0 n

) \# S* H) I8 G) i　　2.2免疫组化及血管密度检测& f8 g3 N2 q: `2 K$ r/ D- ~
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0 l- N/ B* f! Y3 @6 S' c' b　　光密度量化分析得出：支架周围梗死区OD值：TSC组（6447±403），TS组(6201±443)和TC组（6157±291），较T组（2581±428）有非常显著升高（P0 v2 f9 h% R/ R) G

  `3 g9 A. u9 U! z  n  p0 ?  y　　2.3移植细胞鉴定. g+ N2 l4 Y, O6 p

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3 D  m( ^2 N- T/ _- f% X, F# e  o; ~" l; E: Y
　　免疫荧光采用FITC标记的二抗，此时相应细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。结果显示，术后6周移植细胞发出的红色荧光与vWF相应二抗的绿色荧光在很多区域相重合，说明移植细胞分化为血管内皮细胞，参与新生血管网的形成，未检测到心肌及平滑肌分化迹象（图2，见封二）。
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3 X& {$ W, t& t; ?3 L* W　　3讨论
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" ^# y' G3 R( T3 @
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　　目前，多种治疗方法已被用于缺血性心脏病的治疗。其中包括：干细胞移植、促血管新生蛋白因子治疗以及心肌打孔血运重建术等。这些办法都为心肌缺血及左室功能障碍的病人提供了治疗希望，但其各自又存在着不可避免的缺陷。本研究中，我们通过联合TMDR及复合bFGF的肝素化蛋白缓释释放系统进行干细胞移植。结果显示，这种联合治疗方式可以很大程度的避免单独治疗中的不利环节，彼此促进，更有助于血管的新生，血液循环的改善及细胞存活。  |/ B& `. s* z, I

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　　早期的研究已经表明：激光打孔心肌血运重建术对不适合外科手术及传统方法治疗的终末期冠心病患者起到了一定的治疗作用［5］，但它会对周围心肌组织带来热损伤，并最终由纤维化瘢痕占据其孔道［3］，这样的缺点大大限制了它的应用。因此，我们在研究中采用了3.0mm的机械性钻孔，同时在TMDR孔道内置入复合bFGF的肝素支架，我们证实TMDR后置入复合支架会带来显著的促血管生成效应从而刺激孔道周围新生血管网的形成并且对心脏组织无热损伤。在此基础上进行干细胞移植可进一步加强上述作用。我们推测，这些结果可用以下原因解释：
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) O- V& A5 x5 W　　bFGF作为多种细胞的有丝分裂原和趋化因子，可通过刺激内皮细胞，血管平滑肌细胞的增殖实现较强的促血管生成作用。因此，局部应用bFGF可能促进缺血区的血流灌注从而为移植细胞提供氧气及营养物质平台。但由于bFGF血浆半衰期短，单独存在易被降解等缺点，传统的给药方式已不适宜用于治疗性研究［6］。本实验中，蛋白缓释释放系统用无细胞毒性的可降解材料PLGA作为药物载体层，降解周期6～9周能够达到随PLGA降解而缓慢释放药物，延长bFGF半衰期的作用。bFGF属于肝素结合的生长因子，肝素可以通过稳定bFGF的分子构象而延长其生物效应［7］，因此，将支架肝素化的方法可以保持bFGF的生物活性，使其更有效的发挥生物作用。bFGF支架还为局部组织提供了炎症反应平台，有助于炎症细胞分泌的促血管生长因子发挥作用［8］。在这种强大的促血管生成作用下，细胞的生存环境得以很大改善，适于存活分化。另外，TMDR后引发炎症反应亦能为干细胞提供炎症反应平台，从而触发他们的血管源性分化［9］。研究表明，BMSCs本身又可分泌一系列的促血管生长因子如bFGF、VEGF、IL-1等，这些生长因子可促进侧枝循环的建立［10］。本实验中因受上述作用保护，BMSCs自身分泌促血管生长因子的作用可能得到加强。总之，联合治疗能够极大地调动内源性及外源性促血管因子共同发挥促血管生成作用，从而使血流灌注得到改善。1 U8 m$ c5 o7 l$ a& e# B1 r
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　　干细胞具有自我更新和多向分化能力,是治疗损伤性疾病的良好种子细胞。本实验中培养BMSCs经表型分析，Flk1的阳性率可达60%，而CD31、C34均为阴性。以往的研究表明，Flk1（fetal liver kinase）是VEGF的受体，能够在VEGF作用下通过细胞内信号通路刺激Flk1 CD34-CD31-间充质干细胞亚群向血管内皮细胞分化。体内移植实验也已经证实，移植的Flk1 CD34-CD31-间充质干细胞亚群能够在体内损伤微环境的调控下，参与损伤血管的修复及血管新生［11 ］。因此，我们所用的细胞本身具有向内皮细胞分化的强大优势。上述内源性及外源性促血管因子的联合作用，为该细胞的体内分化创造了良好的外界条件。本实验证实，BMSCs分化为内皮细胞，参与了新生血管网的形成。- E; i& K( Y9 g4 {+ L

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, Z  n8 r! @7 \8 D" E$ R　　结论：本实验方法对缺血心肌的血运重建起到了明显的促进作用，同时对移植细胞起到了一定的保护作用。机械性心肌打孔后联合缓释抗凝支架置入及干细胞移植, 是心肌血运重建和治疗性血管生成方法学上的一次创新, 并取得了初步阶段性成果。/ ]# r! \& C$ t+ @" f$ |
          【参考文献】0 P- D- X3 v8 T7 m9 T8 J
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作者: 橙味绿茶    时间: 2015-5-31 17:10

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想  
作者: 科研人    时间: 2015-7-9 15:54

哈哈 我支持你
作者: 张佳    时间: 2015-7-21 22:27

应该加分  
作者: 橙味绿茶    时间: 2015-9-21 09:35

偶啥时才能熬出头啊.  
作者: sky蓝    时间: 2015-9-25 08:18

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想  
作者: awen    时间: 2015-10-4 11:18

继续查找干细胞研究资料
作者: 昕昕    时间: 2015-10-18 09:36

爷爷都是从孙子走过来的。  
作者: tempo    时间: 2015-10-24 10:00

回个帖子支持一下！
作者: marysyq    时间: 2015-10-25 21:04

好贴坏贴，一眼就看出去  
作者: nauticus    时间: 2015-11-11 09:35

帮你项项吧  
作者: txxxtyq    时间: 2015-11-14 17:38

好啊，，不错、、、、  
作者: 陈晴    时间: 2015-11-15 16:14

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。  
作者: 命运的宠儿    时间: 2015-11-20 18:00

真是汗啊  我的家财好少啊  加油  
作者: 杏花    时间: 2016-1-15 10:27

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵  
作者: MIYAGI    时间: 2016-1-16 01:15

一定要回贴，因为我是文明人哦  
作者: dypnr    时间: 2016-2-13 15:11

做一个,做好了,请看  
作者: haha3245    时间: 2016-2-14 14:17

宁愿选择放弃，不要放弃选择。  
作者: xuguofeng    时间: 2016-2-17 10:27

照你这么说真的有道理哦 呵呵 不进沙子馁~~~  
作者: youngcell    时间: 2016-2-24 15:18

楼主福如东海，万寿无疆！  
作者: 未必温暖    时间: 2016-4-26 10:18

生殖干细胞
作者: 求索迷茫    时间: 2016-5-2 14:33

是楼主原创吗  
作者: 追风    时间: 2016-5-3 15:17

加油站加油  
作者: yunshu    时间: 2016-5-6 19:00

干细胞疾病模型
作者: tian2006    时间: 2016-5-22 13:23

今天临床的资料更新很多呀
作者: HongHong    时间: 2016-5-23 15:01

帮你顶，人还是厚道点好  
作者: haha3245    时间: 2016-7-11 14:10

正好你开咯这样的帖  
作者: DAIMAND    时间: 2016-8-7 22:40

貌似我真的很笨????哎  
作者: yukun    时间: 2016-8-25 10:54

有空一起交流一下  
作者: awen    时间: 2016-8-25 12:01

问渠哪得清如许，为有源头活水来。  
作者: 三好学生    时间: 2016-9-1 09:27

干细胞研究非常有前途
作者: keanuc    时间: 2016-10-10 12:01

顶你一下.  
作者: keanuc    时间: 2016-10-15 00:27

真是有你的！  
作者: 碧湖冷月    时间: 2016-10-15 17:01

初来乍到，请多多关照。。。  
作者: tuanzi    时间: 2016-10-16 21:54

水至清则无鱼,人至贱则无敌!  
作者: 小敏    时间: 2016-11-5 20:16

真是汗啊  我的家财好少啊  加油  
作者: 陈晴    时间: 2016-11-8 18:34

每天到干细胞之家看看成了必做的事情
作者: leeking    时间: 2016-11-9 10:27

顶下再看  
作者: 杏花    时间: 2016-12-14 22:49

我在顶贴~！~  
作者: 兔兔    时间: 2017-1-11 08:44

我有家的感觉~~你知道吗  
作者: tempo    时间: 2017-1-29 21:37

嘿嘿  
作者: dataeook    时间: 2017-3-2 22:10

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了  
作者: 快乐小郎    时间: 2017-3-7 19:19

今天再看下  
作者: laoli1999    时间: 2017-3-27 00:52

孜孜不倦， 吾等楷模 …………  
作者: dmof    时间: 2017-4-7 20:27

干细胞美容
作者: 兔兔    时间: 2017-5-14 09:10

不错，看看。  
作者: 一个平凡人    时间: 2017-5-22 13:27

支持~~  
作者: whyboy    时间: 2017-6-17 11:18

不错不错,我喜欢看  
作者: 咕咚123    时间: 2017-6-18 13:43

(*^__^*) 嘻嘻……  
作者: MIYAGI    时间: 2017-7-10 17:18

一楼的位置好啊..  
作者: SCISCI    时间: 2017-7-22 22:17

说的不错  
作者: 天蓝色    时间: 2017-8-6 12:10

胚胎干细胞
作者: s06806    时间: 2017-8-9 13:27

(*^__^*) 嘻嘻……   
作者: 泡泡鱼    时间: 2017-8-12 19:10

谢谢哦  
作者: highlight    时间: 2017-8-23 10:01

琴棋书画不会，洗衣做饭嫌累。  
作者: 心仪    时间: 2017-8-27 01:18

顶也～  
作者: txxxtyq    时间: 2017-9-6 14:16

这个贴好像之前没见过  
作者: 365wy    时间: 2017-9-18 10:27

朕要休息了..............  
作者: dr_ji    时间: 2017-10-14 21:53

内皮祖细胞
作者: 老农爱科学    时间: 2017-10-26 23:20

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界 。。。。。。。。。  
作者: 8666sea    时间: 2017-11-9 07:09

…没我说话的余地…飘走  
作者: 快乐小郎    时间: 2017-12-13 11:27

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了  
作者: mk990    时间: 2017-12-14 10:43

帮你项项吧  
作者: 求索迷茫    时间: 2017-12-19 13:18

谢谢干细胞之家提供资料
作者: syt7000    时间: 2018-2-4 05:25

呵呵,支持一下哈  
作者: 我学故我思    时间: 2018-2-18 23:39

写得好啊  
作者: 加菲猫    时间: 2018-2-19 22:18

祝干细胞之家 越办越好~~~~~~~~~`  
作者: pengzy    时间: 2018-2-22 08:54

说的不错  
作者: xm19    时间: 2018-3-1 19:51

干细胞美容
作者: ines    时间: 2018-3-14 10:18

干细胞治疗糖尿病  
作者: 天蓝色    时间: 2018-3-18 00:21

天啊. 很好的资源
作者: 橙味绿茶    时间: 2018-4-13 21:34

干细胞行业  
作者: 咖啡功夫猫    时间: 2018-5-2 19:17

今天临床的资料更新很多呀
作者: ladybird    时间: 2018-5-13 03:41

今天临床的资料更新很多呀
作者: hmhy    时间: 2018-5-18 20:57

貌似我真的很笨????哎  
作者: cjms    时间: 2018-5-19 06:33

哈哈,有意思~顶顶 ，继续顶顶。继续顶哦  
作者: 若天涯    时间: 2018-5-29 17:24

只有一条路不能选择——那就是放弃的路；只有一条路不能拒绝——那就是成长的路。  
作者: 老农爱科学    时间: 2018-6-6 18:09

怎么就没人拜我为偶像那?? ~  
作者: 大小年    时间: 2018-6-16 00:53

你还想说什么啊....  
作者: SCISCI    时间: 2018-6-23 07:23

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!  
作者: 三星    时间: 2018-7-7 05:01

抢座位来了  
作者: frogsays    时间: 2018-7-8 01:50

楼上的稍等啦  
作者: 983abc    时间: 2018-7-8 08:10

慢慢来，呵呵  
作者: 求索迷茫    时间: 2018-7-9 01:27

我的妈呀，爱死你了  
作者: wq90    时间: 2018-7-16 15:10

顶顶更健康，越顶吃的越香。  
作者: 红旗    时间: 2018-7-17 02:02

回答了那么多，没有加分了，郁闷。。  
作者: dada    时间: 2018-7-30 11:51

非常感谢楼主，楼主万岁万岁万万岁！  
作者: dmof    时间: 2018-8-1 19:32

羊水干细胞
作者: 锦锦乐道    时间: 2018-8-28 01:05

谢谢分享了!  
作者: awen    时间: 2018-9-7 22:10

每天到干细胞之家看看成了必做的事情
作者: 昕昕    时间: 2018-9-15 10:27

不错，感谢楼主
作者: 墨玉    时间: 2018-9-21 08:01

帮顶  
作者: awen    时间: 2018-10-19 13:10

今天没事来逛逛，看了一下，感觉相当的不错。  
作者: 科研人    时间: 2018-10-27 18:18

越办越好~~~~~~~~~`  
作者: s06806    时间: 2018-11-24 11:26

偶真幸运哦...  
作者: 王者之道    时间: 2018-11-24 21:14

我来看看！谢谢  
作者: biobio    时间: 2018-12-22 20:37

今天没事来逛逛  
作者: 干细胞2014    时间: 2018-12-29 20:26

在线等在线等  
作者: MIYAGI    时间: 2018-12-31 07:15

造血干细胞
作者: lalala    时间: 2019-1-4 12:39

谢谢哦  



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