作者:杨靖,王庆海,曾秋棠,毛晓波作者单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,武汉 430022 / }( ?8 X/ e7 m7 ~* y
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$ U9 }! h3 @ U" u- ~" g" S 8 [8 k! c9 D! f/ E 【摘要】 本研究探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)对同种异体CD4 CD25 调节T细胞的作用,进一步查明人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节作用的可能机制。从人骨髓中分离培养hMSC,通过免疫组织化学方法检测其表面标记并进行鉴定。从非亲缘供者健康人外周血中提取单个核细胞,在IL2作用下体外培养, 实验组加入不同数量级hMSC(1×103,1×104,1×105)共培养5天,对照组加入PBS。于结束培养前18小时经3HTdR标记后用β液体闪烁计数仪检测T淋巴细胞增殖,流式细胞术检测各组CD4 CD25 T细胞的百分率,RTPCR检测各组细胞Foxp3的相对表达量(Foxp3/βactin),ELISA分别测定上清中TGFβ、IL10、IFNγ和IL12的表达。Pearson检验分析Foxp3相对表达量与CD4 CD25 T细胞百分率的相关性,以及Foxp3相对表达量、 CD4 CD25 T细胞百分率与T淋巴细胞增殖程度(counts per minute, CPM值),细胞因子TGFβ、 IL10、IFNγ和IL12表达量的相关性。结果表明:hMSC能明显抑制T淋巴细胞增殖,且抑制作用与hMSC呈剂量依赖性;实验组各组CD4 CD25 T细胞亚群含量以及Foxp3相对表达水平均较对照组明显增加(p! e% K+ T/ ?9 W
【关键词】骨髓间质干细胞 4 [7 u% t. T: x) k6 n- } & F5 X, a2 X0 ?$ j; i U. V/ y, d" E2 T' V
Effect of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on AllogeneicRegulatory T Cells and Its Possible Mechamism! h" z$ n4 f+ j- C
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YANG Jing,WANG QingHai1,ZENG QiuTang,MAO XiaoBo m- Y# O' X$ Q. H! P ) Y5 x I# O/ h- S. hDepartment of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430022,China;1The Second People Hospital of Yichang, Yichang443000,China( M1 [: l" z& f# Z' n! B2 Q( v
, F1 j$ H4 r! O- B0 }9 t& t7 BAbstractThe study was purposedto investigate the immune regulatory effects of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) on Foxp3 expressing CD4 CD25 regulatory T cells and to explore the mechanism of immune modulation by hMSCs. Human MSCs were isolated and expanded from bone marrow cells, and identified with cell morphology, and the phenotypes were assessed by immunohistochemistry. Human peripheral blood mononuclear cells (hPBMNCs) were prepared by centrifugation on a Ficoll Hypaque density gradient. The hMSCs(1103,1104,1105) were added into wells containing hPBMNCs(1106) from an unrelated donor in thepresence of rhIL2. After 5 days of coculture, the percentage of CD4 CD25 T cells was detected by flow cytometry. T cell proliferation was assessed by [3H] thymidine incorporation using a liquid scintillation counter. The expression of Foxp3 in CD4 CD25 T cells was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Cytokines (TGFβ、IL12、IFNγ、IL10) concertrations of cultured supernatants were measured with ELISA. The results indicated that in all the experiments, the presence of hMSCs with hPBMNCs resulted in a statistically significant decrease in T cell proliferation,in dosedependent manner.The increase ofpercentage of CD4 CD25 T cells in the peripheral CD4 T cell was observed after coculturing lymphocytes with hMSCs (p ) J/ W$ F( d9 @' X7 R8 W s# t8 d+ a( T! P. Y
Key wordsbone marrow mesenchymal stem cell; CD4 CD25 T cell; Foxp3; immune regulatory3 J% R% t0 {; m( I' O+ O
?9 }: Q, E& ]! c0 NJ Exp Hematol 2007; 15(4):785-7893 S' S; m+ J' c
3 S' u/ D& a$ i; A B3 A% k中国实验血液学杂志J Exp Hematol 2007; 15(4)人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)因其具有独特的多向分化潜能[1]而在细胞治疗以及基因治疗领域展现出广阔的应用前景,成为研究者倍加关注的种子细胞。随着研究的深入,人们发现,MSC除具有上述功能外,还对同种异体免疫反应具有负性调节作用[2],能降低同种异体移植后移植物抗宿主反应的发生率。众多学者对其可能的作用机制进行了研究,目前认为可能通过与免疫细胞(如T细胞,树突状细胞,B细胞等)直接接触[3]或通过改变细胞因子分泌网络间接影响免疫细胞发挥效应有关,但确切机制仍不清楚。近年来国外学者研究发现一个具有独特免疫调节功能的T细胞亚群:CD4 CD25 调节性T细胞。这群细胞具有免疫无能和免疫抑制特性,不仅能抑制自身免疫性疾病发生,还可能参与肿瘤免疫的调节[4]。这一发现被认为是近年来免疫学领域的重大突破,也是目前免疫学领域的研究热点之一。Aggarwal等[3]的研究表明,将骨髓间充质干细胞与同种异体单个核细胞共培养后,单个核细胞中CD4 CD25 T细胞的百分率增加,因此认为CD4 CD25 T细胞可能参与了骨髓间充质干细胞的免疫调节作用。近来的研究认为,在人类,并非所有表达CD25 标志的CD4 细胞都是具有免疫抑制性的调节细胞,但叉头蛋白3(Foxp3)是免疫抑制性CD4 CD25 调节性T细胞的共同标志[5]。因此,本实验进一步从分子水平研究了人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)对表达Foxp3的CD4 CD25 调节性T细胞的影响及其发挥负性免疫调节作用的可能机制,为将骨髓间充质干细胞应用于临床提供实验证据。 ( N/ E+ s! t. e: A R' ` }% z; n& m& a0 r4 p" ^7 Y; j材料和方法3 G1 C- C) w7 A( c! k6 V
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( u7 F% ]/ g- n% a+ GhMSC培养1 周左右,出现单个分散存在或几个细胞聚集的克隆,细胞的形态呈现均一长梭形。此后hMSC开始迅速增殖,至10-14天时细胞呈现90%以上的融合(图1)。免疫组织化学染色法显示,hMSC表面特异抗原SH2、SH3、SB21均呈阳性表达,胞膜可见大量棕黄色颗粒,PBS阴性对照未见类似颗粒(图2A, B, C)。# @, {# Y; w$ T/ P; H. ~3 d
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从健康志愿者外周血分选的单个核细胞与非亲缘供者hMSC共培养7天后,其T细胞亚群CD4 CD25 T细胞占CD4 T 细胞百分率较对照组显著升高,hMSC各组与对照组相比差异有统计学意义(p 7 c* m1 b- ?' i2 y" G. Z, G9 h0 b2 e. V+ e d8 I4 s
淋巴细胞增殖 * {* R! c# f" \+ r! X ; B9 b0 d6 a7 k, |1 QhMSC组T细胞增殖能力明显被抑制,与对照组相比,差异具有统计学意义(p8 {9 B7 B2 s" I8 b( f
8 ~. ]! I5 C0 X' f8 jFigure 3.Effect of hMSC (1103,1104,1105) on allogeneic T lmphocytes proliferation.hMSCs inhibit the proliferation of T lymphocytes in dose dependent manner.*p/ d. O3 d5 ]8 U
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细胞因子表达水平 . t% A9 C* Y* z: h2 a0 Q & d+ R$ f$ D+ d9 t4 K8 ghMSC各组(1103,1104,1105)上清中TGFβ、IL10的表达水平均明显高于对照组,INFγ和IL12表达均明显低于对照组,组间比较差异有统计学意义(p3 @6 l; K3 e: A
# Y: b, b0 b% L) `相关分析结果) Y' d9 b1 u/ A& S
3 H' e- s$ X3 lFoxp3 mRNA表达水平与CD4 CD25 T细胞百分率呈高度正相关(r=0.980,p+ G/ ~: k! J8 r, B1 R. W5 r1 w, V
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讨论 8 M& t1 n2 }1 v 7 C& ^4 t. @ h2 Q大量的研究认为,MSC不仅具有多向分化潜能而且具有独特的负性免疫调节能力。动物实验和临床研究均表明,使用非亲缘供者的MSC移植,可抑制受者体内的异基因免疫反应性。虽然已有临床实验将人MSC应用于预防移植物抗宿主排斥反应病[6],但其发挥免疫调节作用的具体机制尚不明确。随着免疫学研究领域的飞速发展,学者们发现,在免疫系统内存在一群CD4 CD25 调节性T淋巴细胞可以通过下调对自身或非己抗原的免疫反应,在阻止免疫介导的疾病中起重要作用。Hori等[7]发现,转录因子Foxp3(forkhead box p3)特异性表达于调节性T细胞,与其生长发育和功能维持密切相关,可作为检测CD4 CD25 调节性T细胞一个较为特异性的指标。2005年,Aggarwal等[3]将骨髓间充质干细胞与同种异体单个核细胞在IL2存在时共培养72小时,结果显示骨髓间充质干细胞能明显抑制单个核细胞增殖,并且发现共培养后单个核细胞中CD4 CD25 T细胞所占百分率增加,因此认为CD4 CD25 T细胞可能参与了骨髓间充质干细胞的免疫调节作用。/ K, e( [% U, P0 {! P2 f
' i5 ^' L- U2 h我们的研究结果与Aggarwal等类似,加入不同数量级hMSC共培养后,同种异体淋巴细胞增殖受到显著抑制,抑制程度与且hMSC 数量呈剂量依赖性,并且CD4 CD25 T细胞占CD4 T淋巴细胞百分率较培养前明显增加。同时,我们进一步检测了共培养前后CD4 CD25 T细胞中Foxp3的表达以及培养上清中细胞因子TGFβ、IL10、IFNγ和IL12的表达水平。结果表明,hMSC组Foxp3的表达明显增强,增加的程度与hMSC数量呈剂量依赖性,同时抑炎因子TGFβ、IL10分泌增加,而促炎因子IFNγ和IL12分泌减少。Pearson相关分析显示:①Foxp3的相对表达量与CD4 CD25 T细胞百分率成高度正相关;②Foxp3的相对表达量,CD4 CD25 T细胞百分率与T淋巴细胞增殖数呈负相关,与抑炎因子TGFβ、IL10的表达呈正相关,而与促炎因子IFNγ和IL12的表达无明显相关性。! M/ E. L5 u* {/ K \: {
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TGFβ、IL10是重要的抗炎性细胞因子,可通过对多种免疫效应细胞的抑制而发挥抗炎作用。但Tse等[8]发现,MSC抑制淋巴细胞增殖的能力,但这种作用并不依赖MSC 所分泌的TGFβ、IL10等因子。已有的研究证实,TGFβ是诱导Foxp3的关键因子,TGFβ调节人CD4 T细胞Foxp3表达,促进CD4 CD25-T细胞表达Foxp3转化成CD4 CD25 调节性T细胞[9]。因此,结合本实验的研究结果,我们推测这种作用可能与hMSC通过分泌抑炎因子TGFβ、IL10促进CD4 CD25-向表达Foxp3的CD4 CD25 调节T细胞转化,进而发挥免疫抑制作用有关。因此,hMSC是否通过分泌细胞因子诱导产生调节性T细胞从而介导免疫耐受, 以及调节性T细胞如何发挥免疫抑制作用的具体机制仍需要更深入地研究。$ A% i/ E( U. R& G
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