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标题: 饲养层细胞的制备 [打印本页]

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-8-5 17:11 标题: 饲养层细胞的制备

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，$ F* j+ f* r/ j. j! r
直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％乙醇浸泡消毒。- _% C9 e& w$ e) E
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。* p" {- W) r8 t" u; c6 s
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。, @7 f3 ?' a% @2 u( w" Z. o
（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。# U r7 [/ O% z- [
（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。& o8 t* ~$ M# Z
（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。' k- e1 q* U, z: a/ a1 @2 @+ R
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。( D7 J7 _, g$ d% q7 i# p9 H+ l$ d
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

作者: yuhaoze 时间: 2012-2-24 10:54

学习

作者: songyang1987 时间: 2012-2-24 11:13

谢谢分享

作者: llecstem 时间: 2012-3-2 13:01

回复懵懂干细胞的帖子
g) r7 l! I& |# q* y I
想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-3-2 15:40

回复 llecstem 的帖子$ M7 D4 ^1 O$ o: W, E4 a
% y _$ B' E, @$ ~" _/ s6 `
这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
估算一下时间吧。

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:55

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 10:47

回复 zdgrp 的帖子

肯定是需要用的

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 10:47

回复 llecstem 的帖子
, m' Y- p% m0 f( n
这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

作者: igdb 时间: 2012-3-9 09:54

回复懵懂干细胞的帖子

第一代不是应记做P0嘛？？

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-3-11 17:06

回复 igdb 的帖子3 J' F9 d5 Z9 H; _( l/ k9 ]

是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的

作者: igdb 时间: 2012-3-12 09:25

回复懵懂干细胞的帖子; `3 T3 E. V- q% ~
' {3 w0 e; |2 c* H
嗯，叫法没关系。。大家别混淆就好

作者: 第一心音 时间: 2013-1-26 19:00

筛网是什么样的啊，谢谢

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