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标题: 我做的“ips”，请战友们指点（附图） [打印本页]
作者: 小刀    时间: 2010-4-28 22:40     标题: 我做的“ips”，请战友们指点（附图）

本帖最后由 细胞海洋 于 2010-4-28 23:02 编辑 ' x- I2 \% y8 m4 A9 G8 r! g* _

: v; a- e0 c1 ^0 ?) a8 T做了大概半年的ips诱导。总之很是不顺利。现诱导四十余日，图片如下，望前辈战友指点  f, z" K# [% p
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[attach]6982[/attach]5 f2 c% S& l: C+ ~$ p$ w1 ~
   诱导体会：
7 w& \+ L0 K0 @/ Y0 E% L* y   1。在诱导过程中大约二十五六天时感觉镜下可见克隆特别多，但是，没几日，克隆就会迅速减少。我是隔日换液，考虑可能因为换液不勤导致克隆分化
2 p/ |: l* O. W2 Y   2.MEF 处理后，细胞生长速度仍然较快，于是就产生了，大量MEF生长的状况4 s2 g( o" v8 _6 _% ?
   3.貌似的小克隆总是不见其生长扩大，不知道原因为何？莫非不是？
作者: 小刀    时间: 2010-4-28 22:50

另外，ips是不是如昙花一现般的即将谢掉了啊？" D% Z  f2 h) @) X! S# L* Z
前辈们请高见！
作者: daviehe    时间: 2010-4-28 23:12

顶楼主
作者: fish_zbw1985    时间: 2010-4-28 23:25

有没有做过AP染色或活细胞染色呢？
作者: 双刀    时间: 2010-4-28 23:50

做的是人的吗？
作者: 双刀    时间: 2010-4-28 23:51

有没有其他照片？怎么大的克隆只有一个？
作者: wangzhuo822001    时间: 2010-4-29 11:04

MEF 处理的丝裂霉素浓度是不是不够？或者是MEF 细胞浓度太大？
作者: wangzhuo822001    时间: 2010-4-29 11:06

还有就是是不是丝裂霉素作用时间不够
作者: anxjs    时间: 2010-4-29 16:53

看你图片，诱导40余日，饲养层居然还有这么高密度，特别是第三张，有点问题啊。MEF处理后还会生长，肯定是丝裂霉素没处理好，我们丝裂霉素浓度为10ug/ml，T25瓶子长满MEF后我们按4ML的液体量MC的，处理2.5h，如果MC配好后很久没有用，最好再摸下时间，可以适当延长30min。克隆多的时候可以挑几个做下AP染色，确认下先。
作者: hansey    时间: 2010-4-30 16:55

你的MEFs还不错，是因为MEFs还在生长的原因吗？
作者: hansey    时间: 2010-4-30 16:56

感觉不是很像iPS克隆
作者: liulilin    时间: 2010-4-30 19:42

感觉不是很像iPS.  丝裂霉素百分之一处理3个小时。
作者: liulilin    时间: 2010-4-30 19:44

一般克隆在感染后15、6天出现 然后越长越大。还有就是iPS的细胞是圆圆的  核大大的。
作者: msliyv    时间: 2010-4-30 21:27

你那些貌似的小克隆像是凋亡的细胞。是不是这些小克隆都表达有导入的基因？另外我猜想你用的不是virus transfection导入方法吧？
% a6 s3 G; e! E& x! n! X5 e$ Q4 M" v% W. ?
回复 1# 小刀
作者: ambassador    时间: 2010-5-1 17:39

另外，ips是不是如昙花一现般的即将谢掉了啊？
# ?+ V1 l7 @* W4 r* V前辈们请高见！
( O1 t9 t" [: b$ i4 X小刀 发表于 2010-4-28 22:50

9 q  T! S" W. P. c" g% W
1 D) U) f- d7 y2 y2 y) B( p# U
/ `9 j8 p& k' q- b    有这方面的担心！我给你看看2010.1.27由斯坦福大学Marius wernig 开发的一种新的细胞编程技术——成体细胞到定向功能细胞的直接转化！这不是跳过了iPS这一步么！！！
作者: raymandd    时间: 2010-5-3 21:41

朋友，
3 W; E+ ], X/ s) v+ _
% L/ `/ e' ]7 R4 R1 l: G我只做过病毒转染的yamanaka， 所以只能给你一些有关这个方面的建议。 . `" `% C- a- a$ ~& [
病毒制备是最关键的， 你可以浓缩一下病毒，每种病毒病毒原液从30ml浓缩至900ul，每次用100ul/孔(6孔板)，（4种病毒共400ul）， 每孔转染3次。9 @/ I; Q2 y# }6 v3 Z, [

5 W* J5 t$ a6 x5 L你应该可以拿到20个克隆。, X' n& }% D% h$ q* H% P9 E+ t# g! s

/ {3 |$ |# s3 ?7 }- L祝好运
作者: Jonathan    时间: 2010-5-6 12:48

回复 1# 小刀
& l9 ?2 \  Q3 b* G( }$ `3 s. t/ g
* [, R' A6 ^& W! w& O. g想问一下LZ，你发的几个图片，一个ips克隆我都没看见。请问你说的“ips”是哪个？) r3 r  q1 E$ ^. N4 E

, `. P' l- e7 c2 ?" M建议一下：加Vc吧。还有VPA，那样你会很快得到ips克隆。
: R! w% E! `3 v' i2 x3 f1 [
& J$ |5 k* B! _还有，想说明一下，LZ发帖时，最好说明是人的或是鼠的ips，不然别人难以判断
作者: ambassador    时间: 2010-5-6 14:26

本帖最后由 细胞海洋 于 2010-5-6 14:43 编辑 : R3 o9 S: L- i- Y& O  L, r6 p8 J
有这方面的担心！我给你看看2010.1.27由斯坦福大学Marius wernig 开发的一种新的细胞编程技术—— ...0 m$ h  b- ]; m+ q4 }7 D4 m
ambassador 发表于 2010-5-1 17:39

, I! k  G' z# a6 y2 A' Q7 c# ]. T- y& i8 [5 \
' o: l' M1 Y. O
7 D* a2 s, `7 K' X3 i/ a0 z8 g
文献已经找到一并分享给大家！' c- N$ P$ y6 ~
Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors
/ t- E# b$ e& I& G* r[attach]7361[/attach]
作者: 上官鑫    时间: 2010-9-4 06:25

请问VC或是VPA的浓度是多少啊？是铺到feeder上再加吗？
作者: iseeyou1210    时间: 2010-9-4 16:46

第一个feeder 太少了,第三个是feeder的长势太好了.
3 k2 [1 v/ x2 g- i! b这些对ES cell的生长都不好,何况ips细胞.
作者: cicadacjk    时间: 2010-9-7 10:29

1. 根本没看到iPS，无需再养
4 S5 I. ~3 m1 e5 ^  i; b* R: z6 ^2. 不知道是人是鼠
% S  Y% c, o! F/ H% }# X5 X3. 不知道用什么感染，是否分盘，分了什么密度8 W) G+ [- R, w8 [
4. 对照GFP效率如何
作者: 透明微笑    时间: 2010-9-19 19:31

1. 根本没看到iPS，无需再养
9 u" b, C0 ^+ p+ }& N: X3 q. s4 d3 ~2. 不知道是人是鼠0 u1 p. V) X9 x7 ]
3. 不知道用什么感染，是否分盘，分了什么密度* @+ T% b2 C" L' O) T
4. 对照G ...  ~1 M1 k7 \& C5 r4 r
cicadacjk 发表于 2010-9-7 10:29
作者: gadfly2008    时间: 2010-9-22 00:06

不用四十天啊 为何那么就呢
作者: gadfly2008    时间: 2010-9-22 00:07

我一般两周就可以又到出来了
作者: luohucy    时间: 2010-9-24 21:44

我顶啊！
作者: wangyimei    时间: 2010-11-9 12:38

我个人觉得你那个不是IPS克隆，不知你在诱导之前仔细的看了没有你的饲养层细胞，我认为那是在做MEF饲养层的时候未被完全消化好的MEF细胞团
作者: wangyimei    时间: 2010-11-9 12:40

尤其是第三张很像



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