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标题: 干货，多能干细胞标准化培养流程！ [打印本页]

作者: 加拿大STEMCELL 时间: 2018-2-9 14:29 标题: 干货，多能干细胞标准化培养流程！

用mTeSR™1培养人ES和iPS细胞9 Y2 R( P6 O+ [+ Y' M

众所周知，mTeSR™1是文献发表最为广泛的hPSC培养基，cGMP级别且无需饲养层，引用文献超过1500篇，被广泛用于各种前沿的hPSC研究中，包括基因编辑和3D悬浮培养等。在接下来的几期微信推送中，我们将推出hPSC维持培养专题，详细介绍多能干细胞的维持培养、传代、冻存和解冻等。
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本期我们就来谈一谈mTeSR™1培养hPSC的标准流程：

1. 细胞在mTeSR™1培养的形态

未分化的人ES细胞（图1A和图2A）和iPS细胞（图3A和图4A）在mTeSR™1中培养，形成紧密的多细胞集落，具有清晰的边界。细胞间紧密的堆积起来，具有高核质比，且核仁显著。健康的集落会无缝的融合起来，在中心有多层细胞，在相衬显微镜下观察，成紧密的细胞簇。mTeSR™1中培养的集落在Vitronectin XF™上生长时更紧密且更圆（图1和图3），而使用Corning® Matrigel®生长的集落则较为分散且形状不规则。在这两种基质上，自发性分化的特征表现为失去集落边界的完整性，一个集落内有不规则的细胞形态区域，或者出现其他的细胞类型等（图1B，图2B，图3B）。# R5 s! l& |5 S0 C. n% l& i9 l* ~
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图1. 在 Vitronectin XF™上和mTeSR™1中培养的人ES细胞的形态特征。（A）最佳传代时的未分化的人ES细胞（H1和H9）。（B）两个未分化的H1集落中间出现自发性分化的区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率：20X，40X和400X。
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图2. 在Corning® Matrigel®和mTeSR™1中培养的人ES的形态特征。（A）最佳传代时期未分化的人ES细胞（H1和H9）。（B）在一个未分化的H1集落旁边自发性分化的区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率： 20X， 40X和400X。1 `* s5 P2 P6 z
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图3. 在Vitronectin XF™和mTeSR™1中培养的人iPS细胞的形态特征。（A）最佳传代时期未分化的人iPS细胞细胞（WLS-4D1和WLS-1C）。（B）在两个未分化WLS-1C集落中间出现的自发性分化区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率：20X， 40X和400X。; s8 D2 O) m8 U1 o8 ^
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图4. 在Corning® Matrigel®和mTeSR™1中培养的人iPS细胞的形态特征。（A）最佳传代时期未分化的人iPS细胞（WLS-4D1和WLS-1C）。（B）未分化WLS-1C集落边界旁的自发性分化区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率：20X，40X和400X。0 y" n, e1 q, J9 k+ Q7 P$ w# J6 X
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图5. 传代1 - 7天后的人ES细胞培养于Vitronectin XF™和mTeSR™1中的形态。人ES细胞（H1）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，第7天是最佳的传代时间。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。% O$ S; |$ v* B) o" d' K) R# N0 d
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图6. 传代1 - 7天后的人ES细胞培养于Corning® Matrigel®和mTeSR™1中的形态。人ES细胞（H1）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍的照片。对这种培养体系，第7天是最佳的传代时间。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。5 S: l# D7 V7 f3 l! Q" K
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图7. 传代1 - 7天后的人iPS细胞培养于Vitronectin XF™和mTeSR™1中的的形态。人iPS（WLS-4D1）细胞的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，最佳的传代时间是第七天。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。  ~  q4 }3 M, [! {6 W- w
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图8. 传代1 - 7天后人iPS细胞培养于Corning® Matrigel®和mTeSR™1中的形态。人iPS细胞（STiPSM001）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，最佳的传代时间是第七天。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。) y, A5 }' T5 c% A

2. 使用mTeSR™1进行培养时如何确定传代时间; ?. y2 Z. p- Z

在mTeSR™1中培养的人ES和iPS细胞，当大多数集落长得大，紧密，集落的中心比边缘更致密的时候，就可以传代了（图5，图6，图7，图8）。使用其他培养基时集落形态会有所不同。在mTeSR™1中铺板第4天，集落可能还没有显示非常致密的细胞堆积，但四天后，集落的密度和大小会迅速增加，同时在传代之前的1-2天，集落的形态也会发生显著的变化。& P$ u) \# r- v% c! b9 T4 A9 t% j* F
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如果将集落传代的太早或者太频繁，在铺板的时候，细胞聚集体也许会变得不贴壁，导致产率降低，而且细胞也可能会开始分化（出现其他的细胞种类和不同的形态）。如果传代时间太晚，培养物可能会开始出现分化的迹象。大概会有24 - 48小时的最佳传代时间窗口。如果出现较大的集落，并具有有致密的中心，需要在24小时内传代。4 L  x& ?. D8 r' U& e' t

3. 试剂和材料的准备: V; A  b/ s/ i+ S% s+ {/ k6 v

3.1 配制mTeSR™1完全培养基3 `( @, V+ E; b0 d1 G3 [: g

使用无菌操作制备mTeSR™1的完全培养基（基础培养基 + 5X 添加物）。下面的示例是配置500 mL的完全培养基。如需准备其他体积，请按照比例调整。9 {- X% [( a' P0 Q3 k$ v$ w4 m3 ?
注意：在室温（15 - 25°C）融解添加物和完全培养基，或者2 - 8°C过夜融解。不可使用37°C 水浴解冻。

（1）将mTeSR™1 5X 解冻添加剂并完全混匀。
注意：一旦解冻，立即使用或者分装并储存于 -20°C，于 -20°C可存贮3个月。不要超过添加剂的有效期。分装的添加剂融解后，立即使用。不可再次冷冻。
（2）将100 mL 的mTeSR™1 5X添加剂加入到400 mL的mTeSR™1基础培养基中，彻底混匀。
注意：如果不立即使用，mTeSR™1完全培养基可以在2 - 8°C存储2周。或者分装并储存于 -20°C可达6个月。不可超过每个单独组分的有效期。分装的完全培养基融解后，立即使用或者在2-8°C保存可达2周。不要重新冷冻。
* D  t6 r) A* J- R( d  h; r如果是无菌制备，mTeSR™1完全培养基可以立刻使用。如果需要，也可以用0.2 μm低蛋白滤器过滤。0 F/ M( d' I7 M% ]8 z% e! C

3.2 培养器皿的基质包被

使用mTeSR™1成功的培养人ES和iPS细胞，需要恰当的基质让细胞聚集体贴附。推荐搭配Vitronectin XF™（产品号 #07180）或者Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matrix（Corning 产品号 #354277）和mTeSR™1配合使用。当需要成分完全确定的培养体系时，推荐使用Vitronectin XF™重组蛋白基质。
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3.2.1 Vitronectin XF™. L: @/ V2 U) X& ^4 V
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用Vitronectin XF™包被培养皿时，需进行无菌操作。
注意：使用非组织培养处理的培养皿（例如非组织处理的6孔板; 产品号 #27147）。
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（1）在室温（15 - 25°C）将Vitronectin XF™解融。* s, [* n( M$ K! n& S- V, y4 J
（2）将Vitronectin XF™用CellAdhere™稀释缓冲液（产品号 #07183）稀释到终浓度10 μg/mL （例如，40 μL的Vitronectin XF™加入到每毫升的CellAdhere™稀释缓冲液中）。用50 mL的聚苯丙乙烯尖底管稀释Vitronectin XF™。
（3）温和的混匀稀释的Vitronectin XF™，不要涡旋震荡。
（4）立即使用稀释好的Vitronectin XF™溶液包被非组织处理的培养基。表1是推荐的包被体积。" J6 R" K. ~. M0 O5 K3 O
表1. 包被培养皿的推荐体积

培养皿*	稀释后的基质体积
6孔培养板	1 mL/孔
10 mm培养皿	6 mL/培养皿
T-25 cm2培养瓶	3 mL/培养瓶
T-75 cm2 培养瓶	8 mL/培养瓶

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* 包被Vitronectin XF™需要使用非组织处理的培养皿。
（5）轻柔的前后摇晃培养皿，让Vitronectin XF™溶液均匀的覆盖培养皿表面。2 q' A$ {. h0 y
注意：如果培养皿的表面没有被Vitronectin XF™完全覆盖，不可用于人ES或iPS细胞的培养。/ A( p* }% u1 `( g
（6）使用前在室温（15 - 25°C）孵育至少1个小时。不要让Vitronectin XF™ 挥发。1 X+ {' ?& |- Z$ C
注意：如果不是立即使用，培养皿必须密封防止Vitronectin XF™溶液的蒸发（比如使用Parafilm®密封），在2 - 8°C 可以存放一周。使用前，经冷藏的包被培养皿需要在室温（15 - 25°C）下放置30分钟以恢复到室温。4 `/ D% a! N6 P2 t2 h
（7）轻轻的将培养皿向一侧倾斜，让多余的Vitronectin XF™溶液集中在一侧。用吸管或者泵吸取多余的溶液。" L9 s  y1 c' B8 R
注意：不要刮花包被的表面。% R( f# X' d" m
（8）用CellAdhere™稀释液清洗一次培养皿（例如，如果用6孔板，用2 mL/孔清洗）。8 y! Z. @9 Q/ n
（9）吸走清洗液，加入mTeSR™1 培养基（例如，6孔板，每孔加入2 mL）。  y5 I6 U  Q* n6 u
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3.2.2 Corning® Matrigel®9 F9 e9 p9 S6 q, @% i

请参考我们的往期微信推送“【技术窍门】Matrigel™，您是否用对了？”: w9 s0 `/ b; j
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欲了解更多有关干细胞培养的相干内容，包括如何转换干细胞的培养体系，请参考我们的技术手册：在mTeSR™1中维持培养人多能干细胞。您也可以点击这里申请纸质版操作手册。

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下期我们将在微信上推送“干货，如何进行多能干细胞传代？”，每期我们都将有免费的精美挂图相送，敬请期待！

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