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标题: 求助，关于Ki67免疫荧光染色的问题 [打印本页]

作者: 听不到 时间: 2016-3-9 22:19 标题: 求助，关于Ki67免疫荧光染色的问题

对pc3细胞做Ki67免疫荧光染色，但是怎么染，Ki67都是胞浆着色。我查了下，Ki67是核蛋白，应该就是核显色才对啊。我上网查了下，好多人也是出现这样的问题，然而并没找到解决方法。我的整个流程是这样：- d4 f2 T# d4 ^* n6 k
细胞多聚甲醛固定0.5h，0.5%triton打孔0.5h，pbs洗，BSA封闭1h，Ki67在4度孵育过夜，pbs洗，二抗室温避光孵育1h，pbs洗，DAPI室温孵育0.5h，pbs洗，甘油封片，荧光显微镜观察。我对于免疫荧光已经做过很多次了，自认为没有什么手法问题。希望有大神可以帮解决下。
下面是我做的片子：( b# P4 j% s; f2 X4 }# d, b6 r! w
ki67

图片附件: [dapi] 图像_20649.jpg (2016-3-9 22:19, 102.28 KB) / 下载次数 630
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http://stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzYxNTN8ODQ1Yjk2ZDJ8MTcxNTgzMDI2M3ww

作者: 听不到 时间: 2016-3-9 22:20

忘说了，红色荧光是ki67，蓝色是dapi

作者: 顺其自然 时间: 2016-3-10 22:23

可以看出第一张Ki67的荧光图片背景很脏，所以，我猜测是否因为一抗的浓度过高引起的啊，因为可以看到除了胞浆强荧光外，胞核其实也有部分荧光信号的，估计那就是你要检测的Ki67,但由于一抗浓度过高，导致胞浆着色很强。3 C/ p" \5 D7 p
个人观点，仅供参考，欢迎讨论！

作者: 听不到 时间: 2016-3-11 09:10

回复顺其自然的帖子

感谢，总算有人回复了，我一抗按1:200稀释的，不过是按说明书来稀释的，但是我想的是如果一抗再稀释些的话，那会不会只染了胞浆呢，不过我还是试试吧也，谢谢啦~

作者: cneagle66 时间: 2016-3-11 13:47

同求

作者: biovictor 时间: 2016-3-11 14:08

回复听不到的帖子
9 k# C6 @4 X# P2 U9 O
请问楼主是石蜡切片还是冰冻切片？如果是石蜡切片的话，楼主就要注意抗原修复的方法了，如果用的柠檬酸盐水煮法，可以换成EDTA处理，或者蛋白酶消化处理。仅供参考。

作者: 听不到 时间: 2016-3-13 09:39

回复 biovictor 的帖子
) y d$ Z: k! b( K! ^$ A2 n
我是直接细胞长好后用多聚甲醛固定的，理论上不用抗原修复

作者: biovictor 时间: 2016-3-17 20:51

回复听不到的帖子3 `2 t1 V8 N' M/ C! P1 f

哦，我还以为是切片呢！那就不是抗原的问题，在下认为可能有两个问题：1，有可能是抗体的问题，不知都楼主有木有看看抗体公司的描述？2，Ki67主要在核里，但是在胞质里多多少少有一点儿，因此，比较大的可能是核膜没有打穿，楼主有木有换一种透化液，0.5%TritonX-100浓度有点儿低啊！

作者: 听不到 时间: 2016-3-22 13:20

回复 biovictor 的帖子

0.5%低吗？我看大家用的都是0.1,0.2%的呀。至于这个核膜没打开的事我问了我老师，他说既然细胞膜被打孔了，理论上核膜就也被打孔了，而且貌似核膜本身就是有孔的吧？我现在怀疑是一抗不好使，打算换个一抗

作者: biovictor 时间: 2016-3-28 21:53

回复听不到的帖子" I9 M q' _* s/ A
/ W1 U" t- B8 n" K' L( A
嗯嗯，一抗不好使，这是最最最令人无奈的了，加油楼主！

作者: zhangmingqi111 时间: 2016-3-30 22:34

一抗不好使为什么细胞浆会着色呢？

作者: 听不到 时间: 2016-3-31 18:11

回复 zhangmingqi111 的帖子
% l2 P5 [9 z% }7 h0 v2 T% U4 f
对这个完全无解...

作者: alice1990424 时间: 2016-12-5 13:22

请问楼主最后这个问题解决了吗？是换了好用的一抗吗？我现在遇到了和你一样的问题……

作者: 细胞海洋 时间: 2016-12-6 15:14

回复 alice1990424 的帖子) ^$ [* w1 ^3 J+ Q8 m5 a8 P

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作者: sunqing199598 时间: 2019-5-6 13:23

回复听不到的帖子8 K' l& j0 J; C3 L( J) p [" }
" d& x: [: m8 q0 ^9 g
你好我看了你16年的帖子做的ki67 我发生了跟你一样的情况想问你最后怎么解决的？是把一抗继续稀释了嘛？还是换了抗体呢

作者: sunqing199598 时间: 2019-5-6 13:23

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你好我看了你16年的帖子做的ki67 我发生了跟你一样的情况想问你最后怎么解决的？是把一抗继续稀释了嘛？还是换了抗体呢

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