有人养小鼠骨髓间充质干细胞并传过很多代的吗？

dragon513

         我以前养过其它组织来源的，骨髓来源间充质干细胞总是传两代就不大长了。当时觉得很奇怪，后来无意交流中又认识了曾在香港大学和清华专做小鼠BMSC研究的朋友。我跟他们讲这事，他们说他们也遇到同样的问题了。偶尔（机率很小）能多传些代数但不知道什么原因，感觉有点运气成分。7 m" d. j1 G( s! a9 B  l
    我原本以为是自己操作不好，结果很多人都遇到过这种问题，而且是知名实验室。现在还是能查到一些文献报道用小鼠BMSC能传好些代，但细读其方法并无明显不同，基本上大同小异。6 [6 o& z% m& y5 ?
    我真是搞不明白，有其它实验室做过这方面的工作有类似经历或能够较长期传代的吗？如愿意能否分享下方法或体会吗？

dragon513

另外细胞经检测没有污染或其它异常情况，细胞一直不长。没法长满传代。

踏雪寻梅

不会吧，我传到第7代了，小鼠的。

wangweilie0418

我这做人间充质干细胞的，也到5代了，长势很好啊，而且我这长期培养骨髓间充质干细胞，没有发生过类似的情况，您不妨再养一批试试。

麻团

关注，我养的也是同样情况

dragon513

回复 wangweilie0418 的帖子
- c: e  E, \4 n, \- o& D$ Q8 t! f) S" R
关于BMSC似乎种属间有很大差异性，我做过猪BMSC，问题不大。小鼠BMSC能传3代左右慢慢就不长了。

dragon513

回复 踏雪寻梅 的帖子
9 P; S5 d% B/ }  t9 b: {6 |/ @8 U9 w3 B$ M
无论如何，你们在某个方面克服了某个细节问题。我重复过很多次的，不管你信不信，我原以为这仅是个偶然因素，结果与港大和清华研究生谈及此事时才注意到我们居然遇到过同样的问题。其它人的方法我不清楚，我可以将我们的方法晒一下。    选取6~7周龄健康小鼠，雌雄各半。颈椎脱臼处死后立即用75%酒精浸泡2 min，迅速采集小鼠前后腿，取股骨。采集样品时注意尽量避免血液或其它组织的污染，采集的组织样用4℃预冷的Hanks盐平衡溶液（HBSS）反复清洗。去除股骨和胫骨上的肌肉和筋膜后用4℃预冷的HBSS反复清洗。剪去骨两端关节暴露髓腔，用无血清DMEM培养基冲洗髓腔，将收集的冲洗培养基通过40 μm细胞筛网得单细胞悬液，1 500 rpm离心5 min。去上清后用完全培养基悬浮并接种于35 mm培养皿，37℃培养箱中静置15 min使更易贴壁的巨噬细胞、上皮细胞等贴壁，吸取未贴壁细胞悬液再次接种于T25培养瓶，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24 h后首次换液去除未贴壁细胞，此后每3天换液一次。/ ^; B6 D' s6 z0 O$ o  [3 e/ r
    另外，我们DMEM培养基、抗生素、血清均用的是GIBCO的。第1次按1：2传代，以后按1：3传代。我估计其它实验室方法与这大同小异，我想知道这个方法为何能分离猪BMSC但分离小鼠BMSC时开始都长得很快，传了两代就长得很慢了。请有经验的高手分析下原因。谢谢！

dragon513

回复 麻团 的帖子
% A) k" Z" Y4 W( U9 r5 p  r" X* U+ v$ A& i+ `% I+ r, }9 i5 A
？是与我们还是踏雪寻梅遇到的情况类似？

dragon513

回复 踏雪寻梅 的帖子/ a4 |6 @2 K5 k: p

' |9 |( [% X1 T% y$ F+ c& J既然你们能做好必有过人之处，我对你们实验室的方法关注以下问题：
( U7 j+ n4 N) \2 \! W: P5 h: b+ C1.小鼠年龄。有些是用新生小鼠，我们是做的成年小鼠（6-7周）。* P8 l3 ^0 S) I
2.基础培养基。DMEM-HG，DMEM-LG，DMEM/F12，或其它？我们用过DMEM-HG、DMEM/F12，似乎没有明显区别
# f) _8 _+ G; H* o; u: j, I" a  e3.胎牛血清。我们用的是GIBCO澳洲FBS和GIBCO FBS（MSC qualified），这两种都用过，后者效果更好。
/ C- O6 s  |# U  i2 f4.曾用过Percol密度梯度离心，感觉收集的细胞比较少。从形态上看密度梯度离心后也没感觉更纯，所以就直接采用差速贴壁法了。不知道这是不是我们主要原因。
( |! z) n! K' J, v5. 离心转速和首次换液时间，我们采用1000 rpm，5 min。24h首次换液。

xiaoyurly

培养小鼠MSC最好选用周龄较小的，这样细胞活力才高些。
4 [$ }! `8 u0 P3 g6 k1 s我们实验室用4-5周龄小鼠，全骨髓贴壁培养，20% FBS αMEM培养基，一般都能培养到7-8代。3 q' y7 }* [, H6 r
另，MSC好像不适宜用DMEM-HG培养