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作者：庄铭忠 1 ，肖位保 1 ，徐国兴 2 ( P* w: N2 I% F8 R B0 c
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【关键词】角膜缘移植;造血干细胞移植;p63;免疫组织化学;兔
6 d( t4 f* l3 I0 U$ c! e7 b4 N 摘要: 目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系，为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据。方法新西兰兔30只，分为自体移植和异体移植两组，建立角膜缘干细胞缺损动物模型，分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植。术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只，取包括角膜缘的角膜标本，免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况，比较两组的移植效果。结果自体移植术后1周，供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后，上皮细胞覆盖角膜全层，但是层次非常少;3个月后，干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平，角膜完全上皮化。异体移植1周，干细胞的数量有一定的减少;1个月后，角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后，角膜缘已经检测不到干细胞。结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据，p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标。 关键词:角膜缘移植;造血干细胞移植;p63;免疫组织化学;兔 角膜缘干细胞移植经历十几年的临床应用后，已被证明是治疗干细胞损耗的有效方法。然而直到现在，移植后供体干细胞的去向和结局仍无定论，毫无疑问，有效的术后检测手段是解决这一问题的根本途径。笔者拟通过免疫组织化学方法，半定量检测供体干细胞在受体的存活数量和增殖分化状况，为角膜缘干细胞移植手术的效果提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 动物 新西兰白兔购自上海申旺实验动物养殖场［许可证号:SCXK（沪）2002-0011］。 1.2 主要试剂 鼠抗人p63单克隆抗体（Santa Cruz），SP试剂盒（通用型），购自北京中衫金桥生物有限公司。1.3 方法 1.3.1 动物分组 将30只健康、平均体质量约2kg的新西兰白兔（雌雄错配，眼部均无任何疾患）随机均分为两组，即自体移植组和同种异体移植组。 1.3.2 动物模型 （1）自体移植组:将左眼作为供眼，右眼作受眼。10%戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉缓慢推注全身麻醉，1%的卡因表面麻醉。内外眦部分剪开，1-0丝线牵拉上下眼睑和第三眼睑充分暴露眼球，用直径12mm角膜环钻作周边角膜浅层划界，深约0.1～0.2mm，用剃须刀片在角膜缘后2mm处作环形浅层巩膜划界，板层分离划界之间的组织，取下移植片，上皮面朝上平铺于BSS浸润的纱布上待用。再于右眼角膜缘切除同样大小和厚度的组织，将左眼移植片置于右眼移植床上（注意移植片的上下面以及角膜和巩膜端必须正确）。10-0无损伤缝线间断缝合固定移植片于相应的角膜缘部，刮除右眼其余角膜上皮。以上操作在手术显微镜下进行。术后眼局部每日滴氧氟沙星眼药水3次，金霉素眼药膏涂眼。（2）同种异体移植组:兔角膜缘干细胞移植片交叉移植，移植手术及术后处理与自体角膜缘干细胞移植方法相同。 1.4 观察指标 两组手术移植后，分别于第1周、1个月、3个月每组静脉空气栓塞各处死5只，取包括移植区的角膜组织，中性福尔马林固定24h，石蜡包埋，制成石蜡切片（厚0.4μm），再进行免疫组织化学（SP三步法）处理。 1.5 结果判断 免疫组织化学DAB染色的阳性反应物质为黄褐色颗粒，p63抗体的染色部位为细胞核染色。免疫组织化学标记结果以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞记数，使用Motic Images Advanced3.0分析软件（麦克奥迪实业集团有限公司）计算单位面积阳性细胞记数和平均灰度值。 1.6 统计学处理 数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。统计方法选用方差分析计算F值和P值，P 2 结 果 2.1 肉眼观察 自体移植组的结果明显好于异体移植组。自体移植后1周内角膜缘充血水肿和少量分泌物，1个月后基本消退，角膜恢复透明，但是没有恢复到正常的上皮细胞的结构和功能;3个月后，角膜上皮与正常角膜基本相同。异体移植1周内移植组织充血和水肿较自体组明显，移植组织水肿、混浊，部分组织游离，1个月后大部分移植组织游离或者丢失，角膜出现不同程度的溃疡，新生血管长入角膜，3个月以后可见持续的角膜炎症反应，新生血管覆盖全角膜，角膜结膜化，失代偿。两组移植后变化肉眼观察见图1。 图1角膜缘干细胞移植后肉眼观察 略 2.2 p63免疫组织化学检测 自体移植后1周，供体干细胞的存活数量和增殖分化状况没有明显变化;1个月后，供体干细胞的增殖、分化和迁徙情况良好，子代细胞完全覆盖角膜，但只有2～3层;3个月后，供体干细胞增殖分化的子代细胞完全覆盖角膜并增殖到正常的层次，角膜缘的阳性细胞数量也基本上达到了正常角膜干细胞的水平。而在异体移植组，术后第1周内阳性细胞的表达率减少;1个月后，角膜中央未见上皮生长;3个月后，供体组织基本上检测不到阳性细胞。两组免疫组织化学检测见图2。2.3 两组之间单位面积的阳性细胞记数（每1000μm 2 ）和平均灰度值见表1。 图2p63免疫组织化学检测（略） 0 H6 ]1 g; Y+ b% X
表1p63阳性细胞数及灰度值比较 略 3 讨 论 p63基因最初由Schmale等在老鼠发现 ［1］ ，此后又相继在人身上发现了p63基因及其表达的p63蛋白。研究表明，p63主要表现为ΔNp63的功能，即促进转化细胞生长，抑制细胞周期的停滞和凋亡。Yang和Parsa等在1999年曾报道ΔNp63在上皮细胞呈高表达，主要是选择性地表达在各种上皮细胞的基底层，如子宫颈、前列腺、泌尿生殖道以及角膜等各种组织 ［2-3］ 。2003年Wang等第一次发现，在新西兰兔的角膜缘标本中也有p63蛋白阳性表达（4A4单克隆抗体标记），并且主要表达在角膜缘上皮细胞的基底层 ［4］ 。 Pellegrini等为了证实角膜缘干细胞的存在，通过将3T3-J2细胞与人体角膜上皮细胞共培养，结果发现，角膜缘干细胞确实特异性的表达一种多肽-p63蛋白;该蛋白大量表达在角膜缘干细胞，但是在它直接子代分化细胞―短暂扩充细胞表达量明显减少。因此认为可以将p63蛋白作为鉴定角膜缘干细胞的特异性的检测指标 ［5］ 。 笔者的研究结果表明，p63表达的部位主要在角膜缘基底层。在部分增殖活跃的标本中，角膜缘基底上层也有一定的表达，推测这个指标的表达部位应该是干细胞和一部分增生活跃的短暂扩充细胞。肉眼观察显示，自体移植组的结果明显好于异体移植组;从免疫组织化学检测阳性细胞数和灰度值的统计学分析来看，两组之间的差异也反映了移植效果的明显差别，移植标本各个时期的p63表达差异基本上和同期肉眼观察的结果相吻合。提示p63标记的阳性细胞数和角膜上皮化结果密切相关，同时也间接反映了p63标记的结果具有比较好的客观性和可靠性，可以作为角膜缘干细胞的标记和检测指标。 从角膜缘干细胞移植术后干细胞的储备数量以及角膜上皮的覆盖情况来看，国内外的研究结论是相一致的 ［6］ 。笔者认为，干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局，有效的干细胞存活数量的检测手段（特别是客观可靠的检测指标）能够为临床角膜缘干细胞移植手术效果提供依据。 参考文献: ［1］ Schmale H，Bambergen C.A novel protein with strong homology to the suppressor p53［J］.Oncogene，1997，15:1363-1367. ［2］ Yang A，Schweitzer R，Sun D，et al.p63is essential for regen-erative proliferation in limb，craniofacial and epithelial develop-ment［J］.Nature，1999，398:714-718. ［3］ Parsa R，Yang A，Mckeon F，et al.Association of p63with pro-liferative potential in normal and neoplastic human kerationcytes［J］.J Invest Dermatol，1999，113:1099-1105. ［4］ Wang DY，Hsueh YJ，Yang VC，et al.Propagation and pheno-typic preservation of rabbit limbal epithelial cells on amniotic membrane［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44:4698-4704. ［5］ Pellegrini G，Dellambra K，Golisano O，et al.p63identifies ker-atinocyte stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，13（6）:3156-3161. ［6］ Li QJ，Ashraf GM，Rana TS，et al.Long-term survival of allo-geneic donor cell-derived corneal epithelium in limbal deficient rab-bits［J］.Curr Eye Res，2001，23（5）:336-345. Detection and Analysis of Donor Stem Cells after Limbal Stem Cell Transplantation ZHUANG Ming-zhong，XIAO Wei-bao，Xu Guo-xing 1.Department of Ophthalmology，The Affiliated Second Hospital，Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China2.Department of Ophthalmology，The Affiliated First Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China ABSTRACT: Objective To investigate the correlation between the survival of donor-derived limbal stem cells and the reepithelization of cornea，and to provide evidence and evaluation for limbal stem cell transplanta-tion. Methods Thirty New-Zealand rabbits were divided into two groups:the autograft group and the allo-graft group. Corneal epithelial stem cells were obtained by autograft and allograft limbal stem cell transplanta-tion. The corneal samples were analyzed by immunohistochemistry（SP method）. Results In autograft group，the donor stem cells were still confined to the limbus during the first week;whereas a well-differentiated corneal epithelium was recognized in the first month with cells proliferatition，differention and migration to the central part of the cornea but formed only two to three layers;3months later，a normal stratified corneal epithe-lium with five to six cell layers was found. In allograft group，the marked stem cells decreased during the first week，and nearly no epithelium covered in the first month. In the third month，the cornea was accompanied with chronic inflammation，persistent defects，stromal scaring，neovascularization，and stem cell disappeared. Conclusion The amount of limbal stem cells has a direct influence upon the outcome of reepithelization of cornea. Effective detection of survival of limbal stem cells provides an essential evidence for the result of limbal stem cell transplantation. p63is a specific marker for the signal and identified of limbal stem cells. KEY WORDS: limbus corneae transplantation;hematopoietic stem cell transplantation;p63;immunohis-tochemistry;rabbits2 \: N! ]% f8 R7 U8 d, t
作者单位: 福建医科大学 1.附属第二临床医学院眼科，泉州 362000;2.附属第一临床医学院眼科，福州 350005
1 U% B1 l) B- i: v3 T 作者简介: 庄铭忠（1946～），男，主任医师，副教授.
+ w0 m2 W! i* r, E6 g （编辑:常志卫） |
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发表于 2009-3-3 12:38
发表于 2015-6-13 14:11
