免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向成软骨细胞分化 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：徐鹏  赵子义  高鹏  秦大明作者单位：吉林大学第一医院骨科,吉林  长春  130021
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      【摘要】  目的  利用免疫磁珠法分离成人骨髓神经生长因子受体 (nerve growth factor receptor，NGFR)阳性细胞，获得同质性骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs) ，并进行向软骨细胞诱导。方法  采用Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓中单个核细胞 (mononuclear cells，MNCs)，对MNCs进行常规贴壁培养或应用磁分离技术分离NGFR 细胞。分别检测NGFR 细胞和常规贴壁培养所获BMSCs体外扩增和集落形成能力，分析其细胞表型和细胞周期，并进行成神经细胞诱导。结果  免疫磁珠分离获得NGFR阳性细胞的纯度为(90.6±5.1)%，NGFR阳性细胞较贴壁培养获得BMSCs具备更强增殖能力和向软骨分化潜能。结论  利用免疫磁珠分离骨髓NGFR阳性细胞可以获得同质性原始BMSCs。
      【关键词】骨髓间充质干细胞;组织工程;神经生长因子受体
   　　Isolation，purification and directed differentiation to cartilage cell of bone marrow mesenchymal stem cells by immunomagnetic beads method) s/ P$ b: L6 q# f# ?
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　　XU Peng, ZHAO ZiYi, GAO Peng, et al9 H% s; I) a9 q8 m

　　Department of Orthopaedics, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China( G& G, ~# @; a$ d
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　　【Abstract】ObjectiveTo isolate homogeneous primitive bone mesenchymal stem cells (BMSCs) from adult bone marrow by immunomagnetic selection of nerve growth factor receptor (NGFR) positive cells. MethodsHuman mononuclear cells (MNCs) were isolated by gradient density centrifugation with Percoll solution from adult bone marrow sample. The MNCs received routine plastic adherence culture or screened for NGFR  cells by immunomagnetic selection technique to assess for their proliferative capacity and colony forming efficiency respectively and to analyze cell surface phenotype, cell cycle analysis and neurogenesis inductions. ResultsThe purity of NGFR  cells obtained by immunomagnetic selection was (90.6±5.1)%. NGFR  cells proliferated faster and had stronger potential of neurogenesis differentiation than BMSCs separated by routine culture.ConclusionsImmunomagnetic isolation of bone marrow NGFR  cells makes it possible to obtain homogeneously primitive BMSCs.

　　【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Tissue engineering; Nerve growth factor receptor9 o& ~' ?( L  N4 B* P; l
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　　软骨组织自发修复能力有限，治疗软骨缺损的临床常用方法无法令人满意〔1，2〕。骨髓间充质干细胞（MSCs）能够在体内及体外分化成诸如软骨、骨、肌肉和脂肪等多种组织细胞〔3～5〕。目前BMSCs的分离多采用密度梯度离心法和贴壁培养法，这些方法获得的BMSCs都存在异质性，这不仅干扰对BMSCs生物学特性的研究，在临床应用中也会影响效果，尤其在异体BMSCs移植时，混杂异体造血系细胞会引发强烈的免疫排斥反应。神经生长因子受体(NGFR)是一类在骨髓基质细胞中广泛表达的细胞表面抗原，而在造血系细胞和内皮细胞中不表达。NGFR在胚胎阶段的骨髓基质细胞中表达丰富〔3〕，但在是成体骨髓BMSCs体外培养过程中，其表达逐渐减弱，直至不表达〔4〕。这一现象提示NGFR是一类原始骨髓细胞表面标志。本文利用免疫磁珠标记NGFR抗体分离、纯化人骨髓BMSCs,并对获得的NGFR BMSCs的增殖及向成软骨细胞定向分化潜能进行了研究。

　　1材料与方法6 \6 K. n" G5 f/ V! c

　　11标本来源和主要试剂骨髓来源于正常成人献髓者。鼠抗人NGFR单克隆抗体（Upstate Biotechnology公司），羊抗鼠IgG免疫磁珠（Miltenyi Biotec公司），PE标记NGFR抗体(C401457)（BD PharMingen公司），Percoll （AmershanPharmacia公司）。6 m6 _& Y8 Z  z
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　　12骨髓单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)的收集将采集到的抗凝骨髓经LDMEM 1∶5稀释后，置于等体积Percoll分离液之上，1 000 g离心20 min。收集MNCs，LDMEM洗涤两次，重悬于含20%胎牛血清的LDMEM培养液中。
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　　13BMSCs的分离、培养

　　131BMSCs贴壁(plastic adherence,PA)分离法将2107MNCs接种于添加BMSCs培养液的25 cm2培养瓶中，置于CO2培养箱内孵育。48 h后除去非贴壁细胞，更换培养液，待细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶1比例传代，第2次传代后台盼蓝染色计数。. d+ d& M+ u' K: @7 A' W0 J

　　132NGFR 细胞免疫磁珠分离BMSCs将MNCs与鼠抗人NGFR单克隆抗体在4℃条件下反应15 min，PBS洗涤2次后与羊抗鼠IgG免疫磁珠4℃反应15 min，然后将MNCs放置入“miniMACS”细胞分离系统的细胞分离柱内。无免疫磁珠标记的MNCs（NGFR-部分）流出分离柱，而免疫磁珠标记的MNCs（NGFR 部分）由于磁场作用滞留于分离柱中。移走磁场后，冲洗分离柱即得到NGFR 细胞。获得的细胞经台盼蓝染色法计数后，使用PE标记NGFR抗体(clone C401457) 标记细胞后，应用流式细胞仪检测NGFR 细胞的纯度。$ i+ U. Q% B/ {& _2 O2 `

　　14免疫表型测定用耦联FITC的CD133,CD34,CD105，HLADR和耦联PE NGFR抗体标记BMSCs,用流式细胞仪检测免疫表型。
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　　15成纤维细胞集落形成(CFUF)实验和体外扩增将1104 个NGFR 细胞、1106个MNCs和1107个NGFR-部分细胞分别接种于25 cm2培养瓶，添加BMSCs培养液，置于CO2培养箱内37℃孵育。5 d后换液，9 d后甲醛固定，结晶紫染色。倒置显微镜观察。对细胞数目超过50的集落进行计数。将新分离的5104个NGFR 细胞及3105个PA法分离细胞接种于MNCs培养液中培养。当细胞达到90% 融合时，消化细胞并检测细胞扩增倍数和分化潜能。剩余25%细胞重新接种培养，直至细胞衰老停止增殖。  r& [0 p! S- @3 h5 p1 p7 X$ b$ g

　　16细胞周期分析消化两种分离法获得的细胞，70%冷乙醇-20℃固定24 h，PBS洗涤2遍并重悬，加入10 mg/ml Rnase A 10 μl，10 mg/ml溴化乙锭避光反应30 min,流式细胞仪检测细胞周期。

　　17MSCs向软骨细胞诱导及组织化学分析取2.5105个体外扩增的第3代NGFR MSCs置入10 ml塑料离心管中。800 r/min离心5 min，弃除上清液。诱导组添加1 ml无血清软骨细胞诱导液（无血清软骨细胞诱导液使用含如下成分的高糖DMEM：TGFβ110ng/ml，地塞米松100 nmol/L，维生素C50 μg/ml，转铁蛋白6.25 μg/ml，硒酸钠 6.25 ng/ml，胰岛素6.25 μg/ml， BSA 1.25 mg/ml，亚油酸5.33 μg/ml）；对照组添加等量的含10％FBS的LDMEM。置于含CO2的培养箱内37℃孵育。隔日半量换液，至14 d时中止培养。将实验及对照组细胞团使用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋并切片后分别进行番红“O”和甲苯胺蓝染色。/ b# c* ~  Y% K: W( s' t. E

　　18Ⅱ型前胶元mRNA的表达中止诱导后提取总RNA,设计Ⅱ型前胶元的引物序列，上游：5′TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C3′,下游：5′AGA GTC CTA　GAG TGA CTG AG3′,进行RTPCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测Ⅱ型前胶元mRNA的表达。
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　　2结果+ ?9 ]% Y* U" x7 `7 l: [0 F
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　　21BMSCs免疫磁珠分离纯化效率在每百个MNCs中平均有(2.6±1.2)个NGFR 细胞存在。经过免疫磁珠分离获得的NGFR 细胞数占MNCs总数的(0.57±0.31)%。流式细胞计数表明NGFR 细胞的纯度为(90.6±5.1)%。NGFR 细胞的回收效率(100NGFR 细胞数目NGFR 细胞纯度/分离前NGFR 细胞总数)为(21±7)%。5 G, [9 K, y- F0 f7 ?7 F1 H, N
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　　22NGFR 细胞形态及细胞表型分析NGFR 细胞体积较小，呈圆形外观。24 h之内贴壁，48 h后呈现梭形外观，并迅速增殖形成集落。免疫表型分析表明NGFR 细胞中(90.6±51)%为NGFR ,(46.1±33.4)%为CD34 ,(4.2±2.1)%为HLADR ,(50.7±24.7)%为CD133 ,(9.7±3.1)%为CD105 ；培养4 w后，以上各表面抗原阳性率分别变化为NGFR (35.5±5.9)%，CD34 (2.3±1.7)%，HLADR (2.6±2.3)%，CD133 (1.4±1.1)%，CD105 (89.8±12.8)%。PA分离获得BMSCs免疫表型与培养4 w后的NGFR BMSCs表型基本一致，只是NGFR表达细胞较少〔(7.9±4.8)%〕。. f2 K: a& D% e  }) G0 [7 p+ _9 k

　　23CFUF实验正常骨髓MNCs中只有极少数细胞能形成CFUF，而经免疫磁珠分离获得的NGFR 细胞中富含集落形成细胞。1106个NGFR 细胞平均可以形成3100 (从300到8900)个集落，而接种同样数目MNCs只能形成56(22～113)个CFUF。在NGFR部分细胞没有见到细胞集落形成。* g% U  K5 g$ t/ n8 V6 g/ D

　　24BMSCs体外增殖特点在使用含有20鸖培养液，无需添加生长因子的情况下，NGFR 细胞可以在体外扩增10 w。其扩增倍数较PA法纯化BMSCs平均高出2～3个数量级。' j  h& r( W* z, l

　　25细胞周期分析两种分离纯化细胞培养4 w后，流式细胞仪分析DNA含量。免疫磁珠法分离BMSCs中处于分裂期的细胞比例(S G2 M=12.37%)多于PA法分离BMSCs(S G2 M=9.71%)（图1）。

　　26MSCs向软骨细胞诱导培养后的组织化学分析2.5105个第3代NGFR MSCs体外无血清诱导培养14 d后，组织学切片经番红“O”及甲苯胺蓝染色证实细胞外基质内有大量葡胺聚糖生成（图2，图3）。
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　　27Ⅱ型前胶元mRNA的表达见图4。# ?3 M0 l: e  @& s7 g. w) D0 R
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　　图1免疫磁珠法分离MSCs（2）与PA法分离MSCs（1）（略）2 h$ l1 S- t6 F! K1 r* b1 a
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　　图2MSCs向软骨细胞诱导分化14 d番红“O”染色（略）" p9 I/ P' |1 g9 O  N0 r; v

　　图3MSCs向软骨细胞诱导分化14 d甲苯胺蓝染色（略）

　　1阳性对照组，2培养1 w，3培养2 w

　　图4MSCs诱导过程中Ⅱ型前胶元的表达（略）
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　　3讨论/ ~7 s8 d% l- v

　　种子细胞选择及其规模化扩增一直是组织工程面临的重要课题。BMSCs在体内外适当的诱导环境下可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱、韧带等多种组织细胞。该细胞群来源充足，取材方便，增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能，并且异体移植免疫排斥反应小。近年来，国内外科研人员针对有关BMSCs的分离、纯化、体外扩增和分化潜能等，进行了广泛而深入的研究，但到目前为止，BMSCs的特异性表面抗原标志仍没有明确，并且缺少选择性分离BMSCs的方法。NGFR是一类表达于骨髓和其它组织中的生长因子受体。BMSCs表达NGFR的意义目前并不清楚，已知NGFR参与生长因子信号转导过程以及介导神经生长因子引起的细胞凋亡〔5，6〕。Jones等利用抗成纤维细胞抗体分离成人骨髓BMSCs时发现，新分离的BMSCs表达NGFR，但当BMSCs在体外培养4代后，NGFR表达转为阴性〔4〕。结合NGFR在胚胎期骨髓基质细胞丰富表达这一现象，我们推测NGFR可能是一个原始BMSCs的表面标志。另外NGFR不表达于造血系和内皮细胞，所以利用NGFR抗体分离骨髓BMSCs是可行的。
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　　我们采用免疫磁珠标记NGFR 细胞，NGFR 细胞由于受磁场作用滞留于细胞分离柱内，而无磁珠标记的NGFR-细胞不受磁场影响直接流出细胞分离柱，从而达到分离NGFR 细胞的目的。NGFR 细胞呈圆形外观，体积较小,主要由纺锤形或者大而扁平的成纤维样细胞构成。培养发现NGFR-细胞免疫表型与BMSCs不同，并且也不能形成CFUF。相同培养条件下，与PA法分离细胞相比较，NGFR 细胞能形成更多的CFUF，有更高比例的细胞处于细胞分裂期，培养10 w后，其扩增倍数比前者可高出2～3个数量级。NGFR 细胞的增殖和分化特点显示其是具有更强增殖能力和多向分化潜能的原始BMSCs亚群。虽然长期培养后，NGFR 细胞免疫表型与PA法分离细胞没有明显差别，但新分离NGFR 部分有很高比例的细胞表达CD34和CD133，CD105表达细胞则低于10%。CD133已经被证明是一种比较原始干细胞表面抗原，CD34作为造血干细胞标志性免疫表型，在常规贴壁方法培养的BMSCs上并不表达。有研究表明CD34表达于从成人骨髓直接分离获得的BMSCs,只是在培养过程中快速消失〔7〕。另外CD34 造血干细胞在体外长时间培养扩增后，CD34表达也会逐渐消失〔8〕。同以上研究结果相吻合，我们发现NGFR 细胞虽然在培养初期有CD34表达，长时间培养后CD34表达逐渐转为阴性。CD105表达情况与CD34则相反，随培养时间延长由低表达转为高表达。NGFR 细胞与常规贴壁分离法获得BMSCs的免疫表型差别进一步提示NGFR是原始BMSCs的表面标志之一。

　　由于培养条件不同以及细胞来源个体差异，常规PA培养获得骨髓BMSCs体外增殖能力差异很大，有的BMSCs经15次传代仍能扩增，有的只经过4代即停止复制。我们用NGFR 细胞分离法获得的BMSCs在培养10 w，传代20次后仍然可以增殖。比较同样培养条件下贴壁法纯化BMSCs,其扩增倍数比后者高出2～3个数量级，并且其内含有更高比例的具有多向分化潜能细胞，所以分离骨髓NGFR 细胞获得的BMSCs作为种子细胞应用于组织工程具有明显的优势。BMSCs作为基因治疗的载体细胞是目前的一个研究热点，该细胞经体外转染并表达诸如生长因子之类能促进组织缺损愈合的目的基因后用作种子细胞，可以极大的提高组织工程修复组织缺损的能力，而载体细胞体外扩增能力是决定基因转染效率的关键因素，具备更强增殖能力的NGFR 原始BMSCs无疑是组织工程与基因工程的理想结合点。本实验证明NGFR是一个原始BMSCs表面标志，将其与免疫磁珠分离技术相结合，可从骨髓中筛选出NGFR 细胞，从而获得具有同质功能型和免疫表型的原始BMSCs。这不仅为研究原始BMSCs的生物学特性提供了可靠的细胞分离与纯化方法，更为应用组织工程方法修复软骨组织缺损提供了具有更强增殖和分化潜能的理想种子细胞。骨髓细胞向成软骨细胞方向诱导分化的成功，可较好地解决移植中的免疫排斥问题和供体数量有限等问题，为软骨组织工程提供丰富的种子细胞源。$ c* t5 n( D! o& J& d
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