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回复 5# zhaoyan1983
) j" V1 q+ M3 W$ l: ]* N细致的说,MEF-->IPS需要转基因,就是想办法使得MEF表达那四个因子(当然现在很多方法可以不使用那四个因子了,我们先说这个典型的四因子方法)。如果想把外源基因导入MEF,大致目前有3类办法:1。脂质体法(有细胞毒性);2。病毒法;3。电转法。其中1和3可以直接把外源基因使用物理方法导入MEF的,但是其效率相对低或者对MEF的损伤大,另外其导入后外源基因的表达持续时间比较短,不能随细胞分裂而扩增。 " U; I5 _$ m1 R# N
关于使用病毒的办法,那么就要先制备病毒了。出于安全考虑,目前制备病毒(主要指逆转录病毒和慢病毒)的方法主要原则是:将合成病毒颗粒主要组成部分的基因分别克隆到3-4个载体上,这些载体在进入293细胞后会分别制造出病毒的外壳和核酸,然后包装成成熟的病毒颗粒(这个病毒是经过人工修饰的,已经丧失了感染宿主细胞后进行复制的能力)。我们感染MEF的时候使用的就是293生产处的病毒颗粒。
( M5 A9 x6 t& b2 h& [; c关于为什么不在大肠杆菌中扩增的问题,因为大肠杆菌是原核生物,病毒的复制生产需要寄生于真核细胞的基因表达体系。 为什么选293呢?我们制备病毒的时候当然是希望产的越多越好, 293具有代谢快,增殖能力强 的特点,所以在特定时间能产毒能力比较强,另外293是一类非常容易被转基因的细胞,其同时获得3-4个外源基因效率相对较高。
$ e2 j, H' f, f希望能使你明白。 |
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