TGF-β1对MSCs体外模拟缺血性损伤的保护作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：郑丽芳作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,湖北武汉  430022
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      【摘要】  目的  观察转化生长因子β1（TGF-β1）对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外模拟缺血性损伤的保护作用。方法  采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定；用1、2、5 μg/L 的TGF-β1分别预处理细胞8 h,然后用血清剥夺和低氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价MSCs的凋亡及存活情况；用Western blot方法检测2 μg/L的TGF-β1对Akt和p-Akt表达的影响。结果  密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs,免疫荧光检测显示培养的细胞CD29表达阳性,而CD34表达阴性。用2 μg/L的TGF-β1预处理MSCs后,可抑制SOD诱导的细胞凋亡,其早期凋亡率和中晚期凋亡率均明显下降,与凋亡模型组相比差异具有显著性(F=199.77、232.82,P
      【关键词】转化生长因子β 骨髓间质干细胞缺血细胞保护


THE PROTECTIVE EFFECT OF TGF-β1 TREATMENT ON MESENCHYMAL STEM CELLS INJURY CAUSED BY ANALOGOUS ISCHEMIA IN VITRO ZHENG LI-FANG, MEI YUANG-WU, ZHANG XIAO-QIAO, et al(Department of Neurology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the protective effect of TGF-β1 on mesenchymal stem cells (MSCs) injury caused by analogous ischemia in vitro.MethodsDensity gradient centrifugalization (DGC) combined with adherence method were used to segregate and cultivate rat MSCs. MSCs cultivated to the 3 rd passage were characterized using flow cytometry technique. TGF-β1 with 1,2 and 5 μg/L were pretreated on MSCs for 8 h, then serum and oxygen deprivation were used to cause analogous ischemia of MSCs in vitro. AnnexinV/PI flow cytometry technique was used to evaluate apoptosis and survival of MSCs. Western blot technique was used to detect the expression of Akt and p-Akt when 2 μg/L TGF-β1 was pretreated on MSCs.ResultsDGC combined with adherence method could segregate and purify rat MSCs effectively. The results of flow cytometry showed that CD29 expression was positive while CD34 expression negative for MSCs. The results of AnnexinV/PI flow cytometry showed the number of apoptosis cell of 2 μg/L TGF-β1 pretreating on MSCs was significantly less than that of MSCs after 6 h serum and oxygen deprivation. Western blot technique showed that the ratio of p-Akt to Akt increased after pretreated by 2 μg/L TGF-β1, p-Akt /Akt at 8 h was obviously higher than that of those at other times (P
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［KEY WORDS］Transforming growth factor beta; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Ischemia; Cytoprotection9 m: B$ L( F1 ]' c# q
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近年来，随着干细胞研究的兴起，骨髓间充质干细胞（MSCs）以其具有多向分化潜能、来源充足、体外易扩增、无免疫排异等优点，已经成为细胞移植治疗脑梗死的理想细胞［1，2］。然而，移植细胞在缺血组织中较低的存活率限制了此方法的临床治疗效果［3］。如何提高移植细胞的存活率，实现细胞再生，最终改善神经功能，是目前细胞移植治疗缺血性脑血管病亟待解决的问题。本研究旨在以用血清剥夺和低氧(SOD)处理模拟缺血微环境诱导MSCs 凋亡，深入探讨转化生长因子β1（TGF-β1）是否能够抑制MSCs 凋亡，从而为提高移植细胞的存活率、改善临床治疗效果提供实验依据和理论基础。$ ^2 E2 }0 Z; L* w2 i7 C; C# v

1材料与方法
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1.1实验材料, P- p/ E& F, x( Y

TGF-β1 购自美国SIGMA公司；高级胎牛血清（FCS）、DMEM培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司；AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司；Wortmannin、Anti-phospho-Akt以及Anti-Akt均购自Cell Signal公司。

二氧化碳恒温细胞培养箱(Napco 5410-220， USA)，荧光倒置显微镜（Olympus， Japan)，全自动酶标分析仪 (Thermo electron corporation Multiskan MK3， USA)，流式细胞仪（FACSCLSR，Becton-Dickton，USA)。1 i: J- }5 F6 [5 H% l1 L

1.2实验方法8 c: ^8 s/ b0 T" \
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1.2.1大鼠MSCs的分离SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌下取双侧胫、股骨，剔除表面肌肉和筋膜，剪除两端干端，用无血清L-DMEM冲洗骨髓腔；收集骨髓冲洗液，常温下1 000 r/min离心10 min，弃上清液。用5 mL无血清L-DMEM重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液慢慢滴入装有5 mL的Percoll分离液离心管中，常温下2 000 r/min离心30 min；取中间一层白色混浊液，常温下1 000 r/min离心7 min，弃上清；用无血清DMEM清洗细胞后，将含有体积分数0.20胎牛血清的DMEM重悬细胞沉淀，吹打分散，调整细胞密度。按1105/cm2接种于25 cm2培养瓶中，在体积分数0.05的CO2，37 ℃条件下培养。第3天更换培养液去除悬浮细胞，每3～4 d更换培养液。2周后细胞80%融合。用2.5 g/L胰酶消化传代作为第1代，第3～6代用于实验。
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1.2.2MSCs的鉴定取第3代的MSCs用免疫荧光法鉴定培养细胞。细胞爬片经固定、漂洗、破膜处理后，加入正常的山羊血清封闭，然后分别加入抗CD34、CD29抗体，再次漂洗后加入异硫氰酸荧光黄（FITC）标记的IgG二抗，最后用碘化丙啶 (PI) 染核。细胞核为红色，细胞浆和细胞膜着色呈绿色者为阳性细胞。

1.2.3MSCs体外模拟缺血损伤处理及分组参照ZHU等［4］的方法并稍作修改，通过SOD方式建立MSCs体外模拟缺血损伤的细胞模型。培养细胞(MSCs)用0.01 mmol/L的PBS洗涤2次，以去除残留培养基，加入无血清DMEM，然后将细胞培养瓶或培养板置于密闭的恒温培养箱中，向培养箱内持续缓慢通入含有体积分数0.95的N2和0.05的CO2混合气体。正常对照组：以完全培养基培养，置体积分数0.05的CO2恒温培养箱中进行培养；凋亡模型组：SOD诱导8 h；TGF-β1处理组：分别以1、2、5 μg/L的TGF-β1预处理MSCs 8 h，然后在SOD条件下继续孵育8 h；加抑制剂组：TGF-β1预处理细胞之前加入Wortmannin 50 μg/L孵育1 h。
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1.2.4AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测各组均取6105个细胞，用2.5 g/L胰酶消化，1 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清。细胞用PBS洗2次后悬浮于200 μL Binding buffer中。加入10 μL FITC标记的AnnexinⅤ（AnnexinⅤ-FITC），轻轻混匀，4 ℃避光反应15～20 min。加入5 μL PI、300 μL Binding buffer，混匀，上流式细胞仪测试。实验重复3次。
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1.2.5Western blot检测蛋白的表达收集各组细胞，加入适量的细胞裂解液（含50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 g/L TritonX-100，1 g/L SDS，0.5 mmol/L DTT，1 mg/L Aprotinin，100 mg/L PMSF，1 mmol/L Na3VO4，10 mmol/L NaF)，置冰浴30 min，离心取上清液，Brandford法测蛋白浓度后，加入上样缓冲液煮沸5 min，取适量样品进行SDS-PAGE电泳，将SDS-PAGE的电泳产物转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，羊抗Akt（1∶1 000）、P-Akt抗体（1∶1 000）一抗孵育膜4 ℃过夜，加HRP标记的兔抗羊IgG（1∶5 000）37 ℃孵育45 min，用ECL显色3 min，曝光及定影显影。每组实验至少重复3次。利用激光扫描吸光度分析法半定量测定细胞Akt及P-Akt水平变化。/ U5 y3 t$ C, @3 @) \% T
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1.2.6统计学处理应用SPSS 11.5统计学软件进行处理，结果以x±s表示，多组间比较采用one-way ANOVO中的 S-N-K法。
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2结果, `6 c, `0 t$ K1 a# h* P9 X
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2.1MSCs体外培养、纯化、扩增及鉴定
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经大鼠股骨、胫骨提取的骨髓细胞，用比密度为1.073的Percoll分离液分离，经过贴壁筛选获得MSCs最初数量较少，但随着继续培养，可见MSCs快速增殖，约3周左右细胞生长可汇合至80%~90%，在传代达2~3代以后，细胞进一步得到纯化，形态呈长梭形及多角形，逐渐汇合后呈较均一的长梭形及旋涡样生长（图1）。经免疫荧光检测细胞表面CD34(-)、CD29( )。

2.2TGF-β1预处理抑制SOD诱导的MSCs凋亡
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各SOD组细胞的早期凋亡率（AnnexinV＋/PI－）及中晚期凋亡率（AnnexinV＋/PI＋）与对照组相比明显增高，2 μg/L的TGF-β1预处理的细胞早期凋亡率及中晚期凋亡率与凋亡模型组相比明显降低（F=199.77、232.82，P0.05）。见表1。

2.3Wortmannin抑制TGF-β1的抗凋亡作用

2 μg/L TGF-β1处理2、4、6、8、12、24 h MSCs p-Akt/Akt比值分别为0.69±0.19、0.76±0.17、0.81±0.12、1.28±0.25、0.56±0.12、0.49±0.21，p-Akt表达在2 h时开始升高，8 h达到高峰，其后表达逐渐降低，TGF-β1处理8 h时p-Akt/Akt比值与其他时间点相比差异具有显著性（F=6.306,P
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3讨论
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3.1大鼠MSCs的分离、培养及鉴定, Y) y! D5 z5 C9 a2 U8 |

目前，对MSCs的分离、纯化和培养还没有统一的方法，其常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法［5］。本实验将密度梯度离心与贴壁培养法相结合，用淋巴细胞分离液对全骨髓做梯度离心，去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。贴壁细胞主要是MSCs，也可能混有单核细胞、淋巴细胞，每次传代根据MSCs与造血系细胞贴壁性能的差异，通过换液弃除悬浮生长的造血系细胞，使其得到进一步的纯化。几次传代后，细胞变为均匀有序的成纤维细胞样，连续传5代细胞形态无明显变化。本实验方法具有操作简便、快速、实用、对细胞活性影响小等优点，是一种比较理想的分离纯化方法。/ D# E9 k3 X: W- [7 |) N* @

在对MSCs表型的研究中发现其表型不均一，目前尚没有发现MSCs单一的排他性的细胞表型。MSCs在保持未分化状态时表达，整合素家族成员CD29，黏附分子CD44、CD166及CD105等，而不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞的标志抗原CD34。本实验使用流式细胞仪检测其表达抗原，CD34呈阴性，而CD29呈阳性，细胞均一性在90%以上，符合MSCs的表型特征且细胞纯度较高。/ K" V3 o% g1 J9 m0 m
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3.2TGF-β1对MSCs体外模拟缺血性损伤的保护作用% X! d5 q. i4 F
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在MSCs移植治疗神经系统疾病的研究中，对脑缺血的治疗研究最多。导致神经细胞凋亡和坏死的脑缺血恶劣的病理生理环境，必然对MSCs存活及发挥其治疗功效构成极大的威胁。本研究参照ZHU等［4］的方法以SOD处理来模拟脑内缺血，可观察到MSCs的活细胞数在无血清和低氧刺激最初的6 h内急剧下降，细胞死亡的主要形式是细胞早期凋亡(AnnexinV /PI-)。表明在细胞移植后的初期，细胞在环境的刺激下表现为凋亡。如果细胞的恶劣环境得不到及时的改善，细胞将进入不可逆的细胞坏死。在细胞移植的临床研究应用中，对细胞采取保护性预处理，可以防止细胞的凋亡，提高细胞移植后的存活率。本研究将不同浓度的TGF-β1预处理MSCs 8 h，发现使用2 μg/L TGF-β1可以明显降低无血清低氧MSCs的早期和中晚期凋亡率，对MSCs体外模拟缺血性损伤具有保护作用。0 N( @& {  C0 M: c4 a
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3.3PI3K/Akt信号途径在TGF-β1抑制SOD条件下MSCs凋亡的作用0 x2 {# x! o7 {0 ^& ~

TGF-β1是一种广泛存在于生物体的多功能因子，在不同的细胞中通过不同的机制，具有不同的诱导凋亡和抗凋亡作用［6,7］。人们对其诱导凋亡的机制进行了很多研究，但对其抗凋亡机制还知之甚少。本研究显示，2 μg/L TGF-β1可以显著抑制SOD作用8 h时MSCs的凋亡率，上调p-Akt的表达，而加用PI3K抑制剂Wartmannin可以显著抑制TGF-β1的抗凋亡作用。说明TGF-β1可通过激活PI3K/Akt信号途径从而发挥其抗MSCs凋亡的作用。

作为PI3K的主要下游靶目标，Akt也称蛋白激酶B (PKB)，是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，其激酶结构域与PKA和PKC都有约70%的同源性。当生长因子与受体结合后，可通过Scr同源性(SH)结构域与PI3K的P85位结合，进而激活3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 (PDK1)，PDK1能使Akt丝氨酸(Ser473/474)磷酸化，引起下游靶基因的变化。因此，Akt磷酸化可以作为衡量PI3K活性的指标［8］。研究结果表明，PI3K分子参与调节细胞生长、分化、运动和凋亡等功能，但由于刺激因素不同、细胞种类不同，其具有不同的功能［9］。PI3K/Akt的抗凋亡作用可能涉及以下几种机制:①抑制Caspase-3和Caspase-9的活化；②促进BAD的Ser136位点磷酸化，使之与Bcl-2或Bcl-xL解聚，游离的Bcl-2或Bcl-xL则促进细胞的抗凋亡作用［10］；③阻止线粒体释放细胞色素C，抑制细胞凋亡；④抑制促凋亡基因的表达。: L3 |/ c# `& u- \2 ]$ a

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