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【背景】! ^& \9 S' B6 ?6 s& I
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。& N# k& y' I) e w
/ c4 R) J+ g, j) a1 A【培养原理】
0 F& v9 E, a2 w7 V& k CIK培养用细胞因子和抗体：
7 J( S$ z% s+ G1 M6 q- \1 Y8 e) v$ \; C6 J+ Q' c1 @! t4 y0 d
•CD3激发型单抗：
" N. x8 O0 S& Q2 ^ T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的
4 d9 O8 b$ C1 \' c3 B; z* a 抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与
6 w! M5 y6 ^$ v' F+ z CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4
y" F$ ?7 ^5 ` 或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆的
7 ~0 G; v9 p5 z. t" \% S 免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的+ x( d$ s; c( x$ w% U: @
酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，8 r; A, s4 S" Q
最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的
3 _# ^) U+ j3 S3 O3 ^' M 表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
* _! w3 M( k! T9 ^1 V6 j4 M9 u+ ? w; N
由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特
6 E4 n9 c1 y* V 异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，* q! y# v( b1 Q; d( _& L* ]) J! v J
从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引7 @6 ^0 P# C3 l
起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
; e5 J' k3 P+ m. ^ - C9 H. z# W, V% ]' F# [
此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激* f1 J0 F" {, Y% N: c' b( ]
所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最
( z% L% b' D6 g) M' ?5 O 好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。0 h/ |; k. F. W* E0 g
•IL-2 (白细胞介素-2)8 y% Z+ [8 F2 h B
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2- g0 L" z. x% k# s, m+ z
既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活2 f3 I8 P/ s7 t" D4 @5 N2 d0 d
化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，
0 H$ q" X# V4 V8 y 以促进T细胞的增殖与活化。
3 L# W" @8 P4 A•IFN-g(干扰素-g)
$ B* u+ Z; `( ] IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在
# D" E1 y6 |6 ^" N 诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相
# ~& o9 e0 Z0 ~+ a) P 关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
" N% K8 V' `4 R; }; c" ?• IL-1-a (白细胞介素-1a)
' n7 q$ f4 i( S) v# M/ k+ A7 Z IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提
) ?3 M( S3 V0 o# A6 j 高CIK 的细胞毒作用。( |% l, Y3 K; r1 t. \/ e
& j* r8 Y0 }$ v) e! Y. ]【细胞制备】
2 F1 Y' q3 w, C1. 外周血单个核细胞的采集' U/ s3 Y0 y& [. |
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；& H/ ~& ~# k" E5 R/ S" P5 q% ?3 _
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；. ^# G, |( }8 m7 Q
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。$ c% m6 a: |. u3 w! z+ c& w- t0 d
2. CIK细胞的培养及鉴定
D+ j% c& O c5 b# d$ z" ]( U 2.1 将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培# J$ e( \* T' V8 x
养箱中培养；7 d+ O' V8 [$ ^
2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖。
0 J# n) X, Z: c/ ?6 w3 A( r. S 注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。$ {( O6 t1 }5 m; |# A/ `. I. Z% g
2.3 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；" q; E9 _( p: y5 Y% V; ?" Y# @
2.4 在培养的第14d，收获CIK细胞。
) Y3 b5 {. D/ |* r7 R 2.5 CIK细胞质控：* @) H) K0 V: ^, t
2.5.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；4 J4 H" q4 [! |2 T' x8 l% J
2.5.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。4 X7 e* k! }; F: F4 q- E
2.5.3 细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效' x1 N* x% p' A3 b* g
应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200" ?4 z3 h: ]6 U7 i- z6 {6 b
ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀" n. X$ S. {) h% N! w3 A
伤率。9 R; t+ n9 w0 l* ?
2.5.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检
1 I1 j/ `6 ~" [. e1 ~ 测阴性，内毒素<5 Eu)。 8 G# o O6 B# Z; Y+ ?1 |" v$ ]' n
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【步骤简图】
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发表于 2013-8-1 01:59
发表于 2013-8-1 09:47
