血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:34 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王开友，张鲁平，王  颖，潘  琪作者单位：青岛大学医学院附属海慈医院骨科，青岛  266033 $ |' G2 P+ ]! W/ x
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      【摘要】  ［目的］探讨外源性血管内皮生长因子（VEGF）对人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的影响及其机理，为MSCs构建组织工程化软骨奠定基础.［方法］取人骨髓来源间充质干细胞体外培养，将传代后的细胞分别置于含有800 ng／ml和1 600 ng／ml VEGF的诱导培养基中进行培养，将具有促进细胞增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGFβ1以10 ng／ml浓度配置无血清培养基诱导同组MSCs作阳性对照，观察细胞的增殖，分化。用Ⅱ型胶原免疫组化染色评价不同诱导因素下的软骨基质合成情况。［结果］所有细胞显示了良好的增殖能力，暴露于外源性血管内皮生长因子下的MSCs保持了良好的生长活性，并开始向软骨表型分化，与未添加诱导因子组细胞相比差异有显著性意义，不同浓度VEGF组的细胞合成软骨基质的能力无差异，但均不如阳性对照组。［结论］外源性VEGF具有诱导体外培养的人MSCs向软骨表型分化的能力，但与TGFβ1的诱导能力相比有差距。提示VEGF在MSCs来源的软骨修复过程中充当诱导信息提供者的角色。 0 c5 Q- ]1 Y$ Z' ?) T+ _
      【关键词】间充质干细胞；  血管内皮生长因子；  软骨细胞；  分化( x3 t1 J+ @$ a! L8 m+ f$ G
   Effect of VEGF on chondrogenic differenciation of human bone marrow derived mesenchymal stem cells∥WANG Kaiyou,ZHANG Luping,WANG Ying,et al.Department of Orthopedics,Haici Hospital,Qingdao 266033,China
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Abstract：［Objective］To study the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF)on proliferation of human bone marrow derived mesenchymal stem cells(hMSCs)and its chondrogenic differenciation and to provide a basis for the tissue engineering technology of articular cartilage.［Method］The hMSCs werecultured invitro asusual andits passagewas induced the by medium containing 800 ng/ ml or 1600 ng/ ml the VEGF MSCs the cultured in the medium containing 10 ng/ ml the TGF β1 which the had multiple the biological efficacies the to enhance the proliferation the of MSCs the and to the inhibit the activities of the inflammatory factors,acted as a positive control.The induced MSCs were used to observe its proliferation and differenciation.The synthesis of chondrocyte extracellular matrix in different inducefactor was measured by immunohistochemical staining.［Result］MSCs cultured wit different induced factors proliferated well,MSCs induced by VEGF medium showed a well growth activity and chondrogenic differenciation,but MSCs cultured in TGFβ1containing medium induced more chondrocyte matrix than that in VEGF medium.［Conclusion］VEGF induces chondrogenic differentiation of MSCs in vitro,but MSCs cultured in TGFβ1 medium induces more chondrocyte matrix.It is suggested that VEGF acts as donor of inducer message cartilage repair by MSCs.% p" [; M$ t4 `, o& H

Key words：mesenchymal stem cell;VEGF;chondrogenic;differenciation
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来源于骨髓的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于成体干细胞。在不同的培养液、机械因素、生长因子等因素的诱导下，MSCs可分化为骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等中胚层来源细胞。所以自1999年Pittenger等宣布其分离到成人骨髓来源的单个MSCs并成功的向软骨表型诱导分化之后，MSCs立即成为组织工程领域最热门的种子细胞。一直以来，血管内皮生长因子（VEGF）是血管内皮细胞有效的有丝分裂原，是已知诱导血管再生作用最强的生长因子，并且在软骨组织发生、发育以及再生过程中，VEGF起着重要的调节作用。作者的实验拟通过体外培养的方法观察外源性VEGF对人骨髓来源MSCs的影响，并定量分析诱导后MSCs合成Ⅱ型胶原的能力，为今后MSCs构建组织工程化软骨，应用到临床软骨修复领域奠定基础。
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1材料与方法
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1.1主要试剂及仪器25 ml培养瓶，6孔板、96孔板，15 ml塑料离心管（Costar），0.22 μm滤膜、0.15 μm滤膜，无血清DMEM培养液（HG,LG）（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Sigma），胶原酶（Sigma），淋巴细胞分离液（天津TBD公司），TGFβ1（Sigma），血管内皮生长因子（武汉博土德生物制品公司），小鼠抗人Ⅱ型胶原抗体、羊抗小鼠二抗IgG（均购自武汉博士德生物制品公司），其他化学试剂（EDTA，NaCl,KCl，NaHCO3、青霉素、链霉素等）为进口或国产分析纯试剂。CO2细胞培养箱（HERAcell 150／240，德国Heraeus公司），倒置显微镜及摄像系统（TS100，Nikon日本），精密电子天平（FA2104，上海天平仪器厂），超低温-80 ℃冰箱（MDF382E，SANYO日本），高速冷冻离心机Biofuge Primo R（冷冻型，德国Heraeus公司），恒温磁力搅拌器（85-2B，中国金坛市科技仪器有限公司），精密PH计（PHS-3C，中国上海精密科学仪器有限公司），各型号移液器（法国Gilson公司）。

1.2MSCs的分离和培养骨髓来源于骨科病房住院病人中需行髂前上棘取骨者，所有供髓者均在知情自愿的基础上提供骨髓：1 Z8 k& }+ x0 k4 l: ^

（1）术中髂前上棘取骨时，肝素125 u／ml润管，抽取骨髓5～7 ml，混匀，2 h内进行分离操作。（2）用含10％PBS的LG-DMEM等量稀释骨髓并混匀，1 000 r／min离心5 min。（3）弃去上清和脂肪层，沉淀用DMEM稀释成10 ml体积。（4）在另一离心管内加入淋巴细胞分离液（密度为1.077 103 g／L）5 ml。（5）将骨髓的稀释液沿管壁缓缓地铺在淋巴细胞分离液上，3 000 r／min离心20 min。（6）毛细吸管小心收集界面层的单个核细胞，用DMEMLG反复洗涤2次，以去除残存的淋巴细胞分离液。（7）离心收集细胞。（8）用含10%胎牛血清的LG-DMEM吹打细胞成单个细胞，调整细胞密度至1106／ml，接种于25 ml培养瓶，37 ℃、5% CO2、饱和湿度常规培养。（9）根据贴壁情况，72～120 h后，全量更换新鲜培养液，未贴壁细胞经反复换液，自然去除，待集落形成，细胞生长至80%～90％融合后传代。传代培养时加入0.25％胰酶消化，显微镜下观察纤维形MSCs变圆，倾去消化液，加入培养基，并吹打分散细胞，细胞计数板计数，以5104／ml密度接种于25 ml的培养瓶中。此时细胞记作P1，重复以上操作，获得P1～P5细胞。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。! r! y1 V$ ~0 L6 I/ |
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1.3MSCs的生长曲线测定取生长良好的P1、P3、P5细胞，0.25％胰蛋白酶消化，以5104／ml接种于96孔板，每孔0.2 ml，每天取3孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续7～9 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线。

1.4细胞分组诱导分化取第4代形态均一的MSCs，胰酶消化，以5104／ml密度接种于加有盖玻片的24孔板中，待细胞至70％融合，分3组进行诱导：（1）空白对照组，使用含10％FBS的HG-DMEM自然分化；（2）实验组1，含10％FBS，800 ng／ml VEGF的HG-DMEM诱导分化；（3）实验组2，含10％FBS，1 600ng／ml VEGF的HC-DMEM诱导分化；（4）阳性对照组，含体积比1％ITS，10 ng／ml TGFβ1的无血清培养基进行诱导分化。- X! D1 R3 u8 ^$ C

1.5Ⅱ型胶原免疫组化染色分别于诱导的7、21 d取出盖玻片，按免疫组化试剂盒说明操作。( d3 l% ^- O: N' K, m1 ~" J& V+ F# Y  y

1.6染色结果讨论分析每组抽取Ⅱ型胶原特异染色细胞爬片3张进行拍照，照片保存为JPG格式，应用Photoshop 7.0对染色的结果进行图像分析，得出不同图片的相同颜色的像素数，结果用SPSS 11.5进行统计学分析，实验组与阳性对照组间差异用Dunnett法检验，两实验组间用t检验。
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2结果) s; P0 b, |8 ], E# U- W

2.1原代培养密度梯度离心后收集的细胞形态大多为圆形，用台盼蓝排除法测定活细胞比率均在95％以上。刚接种时，MSCs呈圆形，折光性好，与周围的血细胞相混杂。1～2 d后，少量MSCs贴壁，形态逐步延伸成梭形，即成纤维样细胞，胞核清晰，可见核仁、胞浆内有细小颗粒，核大、圆形或椭圆形。随后培养的2～5 d为生长潜伏期，细胞数量增加不明显，此时细胞数量少，每3 d半量换液。未贴壁的细胞在换液过程中逐步被清除。接种后l周，可见明显的集落形成.每个克隆约由50～80个细胞组成.集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展，逐渐与邻近集落相融合。至培养15～20 d左右接近汇合，细胞呈成纤维细胞样，梭长，排列非常密集整齐，可呈编织状、旋涡状生长。) z% ?7 j7 I( Q  c% Z+ \) p* u# {
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2.2传代培养传代细胞呈均长梭形，紧密排列类似旋涡状。传代后的细胞于24 h内全部贴壁，细胞的生长速度明显加快，经历24～48 h的缓滞期后迅速进入对数生长期，5～7 d长至汇合。体外扩增5代后，细胞数量可达到3108左右。此时小圆形细胞和马蹄形细胞由于贴壁牢固，被弃去，非附壁细胞经反复换液绝大部分已被去除。+ L5 ~1 a0 Q2 x  N3 W9 L

2.3分组诱导分化结果实验组在诱导5 d后即可见细胞形态发生变化，由长梭形变为多角形，类似软骨细胞形态；对照组无变化，仍保持成纤维样细胞形态；阳性对照组诱导2 d即见细胞形态变化。
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2.4Ⅱ型胶原免疫组化染色诱导7 d后，实验组的MSCs在细胞密集处，个别细胞胞浆中呈明显棕褐色，大部分细胞胞浆呈不明显黄棕色。阳性对照组结果类似但胞浆染色浓重，阳性染色细胞数多。诱导14 d后的实验组大部分细胞呈较均匀的淡棕色，而阳性对照组MSCs呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处细胞周围可见点状分布的黄褐色染色颗粒。

2.5染色结果统计分析对照组经免疫组化特殊染色后的照片在图像处理软件上未采集到合格的像素，因此被略去，实验组及阳性对照组采集到的像素数，经统计学分析，两实验组结果之间无差别（t=0.19，P=0.859），但均较阳性对照组为低（P=0.004）。即实验组细胞分泌Ⅱ型胶原量均较阳性对照组少，差异有统计学意义（表1）。

表1染色图像结果分析

分组像素数均数标准差实组组19 253 4007 845 6008 542 50085 471.77 039.1实组组29 452 1007 955 2007 859 90084 224.08 930.2阳性对照组12 515 40014 256 10011 547 800127 731.013 724.0

3讨论: J5 D, v5 C: P; ]1 M! y$ a# F5 W

自1999年Pittenger等〔1〕在Science上发表文章宣布其分离到人骨髓来源的单个MSCs并成功诱导呈软骨表型之后，研究的热点便逐渐被吸引到骨髓来源的间充质干细胞（bmMSCs）上来。该细胞来源易得，取材方便，增殖能力强，可在体外多次扩增而不丢失其多分化潜能，供区损伤小，便于自体移植，并且异体移植时排斥反应小，可对软骨及软骨下骨同时修复，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一〔2〕。然而研究同时发现，骨髓中MSCs的数量随着年龄的增长而逐渐减少〔3〕。' i+ g. P  `8 |* \

血管内皮生长因子（VEGF）是一种能在体外特异性促进血管内皮细胞生长、在体内有效促进血管增生的生长因子，它在机体的生理及病理过程中起着重要作用，在疾病的治疗方面也有着广泛的应用前景。MSCs是多潜能干细胞，可存在于骨髓中，能在体外增殖维持非分化状态并具有分化成骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能〔4～7〕。并且MSCs是一种很好转染靶细胞的种子细胞。# h' G. @9 @$ P& _

作者在实验中发现：密度梯度离心后收集的细胞形态大多为圆形，用台盼蓝排除法测定活细胞比率均在95％以上。刚接种时，MSCs呈圆形，折光性好，与周围的血细胞相混杂。1～2 d后，少量MSCs贴壁，形态逐渐延伸成梭形，即成纤维样细胞，胞核清晰，可见核仁，胞浆内有细小颗粒，核大、圆形或椭圆形。随后培养的2～5 d为生长潜伏期，细胞数量增加不明显，此时细胞数量少，每3 d半量换液，未贴壁的细胞在换液过程中逐步被清除。接种后1周，可见明显的集落形成。每个克隆约由50～80个细胞组成。集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展，逐渐与邻近集落相融合。至培养15～20 d左右接近汇合。细胞呈成纤维细胞样，梭长，排列非常密集整齐，可呈编织状、旋涡状生长。传代细胞呈均一长梭形，紧密排列类似旋涡状。传代后的细胞于24 h内全部贴壁，细胞的生长速度明显加快，经历24～48 h的缓滞期后迅速进入对数生长期，5～7d长至汇合。体外扩增5代后，细胞数量可达到3108左右。此时小圆形细胞和马蹄形细胞由于贴壁牢固，被弃去，非附壁细胞经反复换液绝大部分已被去除。这发现与Pittenger〔1〕的观点一致。

在分组诱导分化过程中，实验组在诱导5 d后即可见到类似软骨细胞形态；对照组无变化，仍保持成纤维样细胞形态；阳性对照组诱导2 d即见细胞形态变化。诱导7 d后，实验组的MSCs在细胞密集处，个别细胞胞浆中呈明显棕褐色，大部分细胞胞浆呈不明显黄棕色。阳性对照组结果类似但胞浆染色浓重，阳性染色细胞数多。诱导14 d后的实验组大部分细胞呈较均匀的淡棕色，而阳性对照组MSCs呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处细胞周围可见点状分布的黄褐色染色颗粒。经统计学分析，两实验组结果之间无差别（t=0.19，P=0.859），但均较阳性对照组为低（P=0.004）。即实验组细胞分泌Ⅱ型胶原量均较阳性对照组少，差异有统计学意义。从以上实验数据作者得知：体外培养的人骨髓来源MSCs显示了良好的增殖能力，但没有发生自发转化现象。在有外源性VEGF的环境中人MSCs发生了向软骨表型的分化，证实外源性VEGF存在诱导MSCs向软骨分化的能力。虽然VEGF和MSCs向软骨表型的诱导分化能力和浓度无关，但都不如TGFβ1作用强大。Shakibaei等〔8〕研究发现，整合素可以促进鼠胚胎肢芽间充质向软骨细胞分化，如使用整合素抗体对抗整合素作用后能抑制分化。胚胎软骨形成时局部有较高水平的TGFβ1表达，TGFβ1可以诱导原始的间充质细胞分化为软骨组织，促进软骨细胞的增殖和成熟，增加软骨细胞合成和分泌蛋白多糖的作用。) L4 \. J1 j1 h5 B/ G; f( X  f
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向软骨细胞分化是个非常复杂的过程，可能还与MSCs自分泌、旁分泌其他内源性细胞因子的相互作用有关。提高受损软骨局部VEGF的浓度不仅能为软骨表面提供分子屏障作用，还对基于MSCs来源的软骨修复有着积极的促进作用，作者的研究结果发现了VEGF和MSCs向软骨细胞分化的促进作用，这为以后MSCs应用到临床工作上奠定了一定的基础。8 k9 f: {( }8 ?( r+ V' V
      【参考文献】$ U$ ?: n- I$ p4 w
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