体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李中华,栾保华作者单位：山东大学附属省立医院烧伤整形外科，济南 250021 $ p. K, R) q7 S' q' N* o+ z- {
   3 q3 @3 ^. s3 Q& d8 G$ \
   , N  [" T) M" V" e9 s& i3 r


            z5 ]5 t3 S, @  Q* S
                  6 A0 C5 a0 M* v
         : T. e$ I# @9 i4 E
                  2 Z* O: u" c, u9 Z) b- Y
      ! R8 O( [3 q' {$ z# Q, w1 F

      8 e. g7 q- u: `7 T+ D
      【摘要】  目的  探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法  密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P2、P4、P7）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果  定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P2、P4间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P7与P2、P4相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论  BMP2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。 / @, Q, l0 m  {% {% {; t
      【关键词】间充质干细胞；软骨细胞；分化；骨形态发生蛋白2

8 Z9 a2 J3 [1 L! S
　　LI Zhonghua, LUAN Baohua7 p, b) b/ z4 k

　　（Department of Plastic and Burn, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China）
: R. W4 j2 D5 J: T4 A, y/ L
　　To explore chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells（BMSCs）in experimental culture medium. MethodsBMSCs, isolated from rabbit bone marrow aspirates by density gradient centrifugation，were cultured, expanded and induced into chondrocytes in defined culture medium containing bone morphogenetic protein（BMP）2 in monolayer culture in vitro. Toliudine blue staining, Masson staining, immunohistochemical staining, and Alcian blue chromatomery of glycosaminoglycan (GAG) were used to determine the differentiation. Statistical analysis of the proliferation and chondrogenic differentiation abilities of the induced BMSCs was deployed among the 2nd, 4th and 7th passages. ResultsInduced BMSCs had characteristics of the chondrocyte. There was no statistical difference in the proliferation and chondrogenic differentiation abilities between the P2 and P4 BMSCs (P＞0.05). Compared with the P2 and P4 BMSCs, the proliferation and chondrogenic differentiation abilities of the P7 BMSCs was decreased（P＜0.01). ConclusionBMP2 can induce BMSCs to differentiate into chondrocytes in monolayer culture in vitro. Cell passage is an important factor in the chondrogenesis differentiation of BMSCs.: h' c$ A" J3 }
, }/ r( p, I/ c/ q* s# f
　　Key words: Mesenchymal stem cells； Chondrocytes； Differentiation； Bone morphogenetic protein2. C! W, E9 |2 Y/ p
1 e0 F5 \6 g6 J3 {. m& B
　　骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体,能在适宜的条件下分化再生骨、软骨［1］、脂肪等细胞，且免疫原性低，是组织工程理想的种子细胞来源。本研究对兔BMSCs进行分离培养扩增，并在特定的培养条件下诱导其向软骨细胞方向分化，旨在建立一种体外培养体系，对BMSCs的分化进行研究，为利用BMSCs修复软骨组织缺损提供理论依据和实验基础。& y7 b' x( q: W% A6 h
! }4 W& a( w$ \5 \6 `
　　1材料与方法- w* ]3 L# P6 M6 ~6 l, P( `5 g% l) \
" \- L! D0 ]; e, L. D' Q
　　1.1实验动物% f0 x5 _2 n9 ~' t9 c3 L

　　3月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不限，体重(2.0±0.2)kg，由山东省农科院畜牧研究所提供。0 Z& ]% h4 t; X; M7 A% l- v
8 ~5 d# ^  o, ~' J# l5 u
　　1.2主要试剂和仪器4 F7 Y& F2 \0 s) W9 B7 E3 Q( \

　　Percoll分离液（Pharmacia公司），胎牛血清、低糖DMEM培养基（LGDMEM）、高糖DMEM培养基（HGDMEM）(Hyclone公司)，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP)2（Peprotech公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），CO2细胞培养箱（Thermo Forma 371，美国），IX71倒置相差显微镜(Olympus，日本),酶联免疫检测仪(Spectra Max M2，美国)。1 \0 n: S, J2 c- ~5 ?1 |4 ]
. e; S6 t$ A$ b9 ^' ^! U
　　1.3兔BMSCs分离与培养+ {0 K( b7 G0 d  }
* y+ o3 a3 v" {! i5 [
　　3%戊巴比妥钠1?mL/kg剂量耳缘静脉麻醉后，无菌操作下,骨髓穿刺针从胫骨近端内侧进入骨髓腔,接10?mL注射器（含3?000?IU/mL 肝素钠0.2?mL）,抽取骨髓3～4 ?mL。用无血清的LGDMEM稀释后, 按1∶1的比例加在密度为1.073?g/mL 的Percoll 液面上，800g离心25?min。离心后缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一离心管,用无血清的LGDMEM洗涤2次,用含10%胎牛血清的LGDMEM(含2?mmol/L谷氨酰胺、青霉素100?U/mL 、链霉素100?U/mL)稀释混匀,以2105/cm2接种于25?cm2培养瓶,在5%CO2、37?℃饱和湿度的条件下培养。3?d后小心将未贴壁细胞全部弃掉,全量换液,以后每周换液2次。当原代培养的细胞呈80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化3～5?min,按1∶2或1∶3传代培养。
3 s) H3 e3 x: H+ V. x/ G# x
　　1.4兔BMSCs向软骨细胞的诱导3 Y7 A! O' x2 G+ T3 v5 |$ j2 N) ]

　　取第2代细胞,胰酶消化，以1106/mL接种于加有盖玻片的12孔板中，行软骨细胞定向诱导。实验组用条件培养液（HGDMEM、2%胎牛血清、100?ng/mLBMP2、10-7?mol/L地塞米松、6.25?μg/mL胰岛素、50?μg/mL维生素C、6.25?μg/mL转铁蛋白）诱导。对照组用含10%胎牛血清的LGDMEM常规培养液自然分化。诱导14?d后，取出盖玻片，用95%冷丙酮固定盖玻片，进行组织学染色。并收集两组细胞换液时的培养液，进行糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）含量的检测。
% {* r8 W' B1 a& \0 L# n- ]
　　1.5成软骨潜能测定
4 m. i: b7 ?0 q( l" c/ F
　　1.5.1形态观察
7 j8 m1 G: b2 I% ]
　　每天在倒置显微镜下观察细胞形态的变化和生长情况。
' E/ k: Q, k+ \! x; p
　　1.5.2甲苯胺蓝染色
2 P6 T8 E1 I) j8 Q$ e
　　自来水充分冲洗玻片，1%甲苯胺蓝室温染色30?min。95%乙醇分化，镜下控制，适时终止，洗去多余染液，透明，封片。6 h  g8 X* q0 e" |
, \, h* ]: i, G  j8 F
　　1.5.3Masson染色; `* T1 m4 ~9 E4 Y4 w6 M" D

　　Mayer氏苏木精染色5?min，水洗至切片返蓝。滴入Masson氏三色染料染色6～10?min。蒸馏水洗净染液后，滴入0.2%醋酸溶液洗20～30?s。酒精脱水，透明，封片。5 e$ K; T8 ^) n  z3 @, c9 w
, z$ p6 u* c/ \+ H5 r( L. C
　　1.5.4Ⅱ型胶原免疫组化染色6 Q0 P3 \( U3 \9 y5 ~* l) |

　　PBS冲洗玻片后，按免疫组化试剂盒说明书行SABC法染色。

　　1.5.5阿利新蓝法测定培养液中GAG的含量. e! Y# U$ |$ p+ k3 {" N( S2 i- \

　　分别取各组细胞换液时的培养液100?μL，加到含1.5?mL新鲜配制阿利新蓝染液的试管内，酶联免疫检测仪490?nm下进行比色，测其吸光度。以硫酸软骨素制作标准对照曲线，计算出各组培养液内GAG含量。比较实验组和对照组分泌GAG的不同。

　　1.6细胞传代对兔BMSCs向软骨细胞分化的影响

　　1.6.1细胞增殖能力的测定2 L( O. c% i& T  l  L

　　随机抽取P2、P4、P7 BMSCs,按1104的密度接种于96孔板，加入条件培养液培养7?d后，采用MTT比色法测定各组在490?nm波长下的吸光度，比较各组细胞的增殖能力。
6 u4 G5 z( G$ A/ s) w" |3 V
　　1.6.2成软骨细胞分化能力的测定

　　随机抽取P2、P4、P7 BMSCs 以1106/mL密度接种于24孔板中，加入条件培养液进行诱导。在诱导后的第14天，取各组的玻片按1.5.4的方法行免疫组化染色，随机计数6个非重复视野内阳性细胞占总细胞数的比例。并收集各组在14d换液时的培养液，按1.5.5的方法测定培养液内GAG含量，进行比较。& i! X# f- R' m; c8 ]- Q( e
. ~* \: @7 t1 S1 q
　　1.7统计学处理7 j. h4 I! C1 K5 M" g& W5 h
$ I; w: a% i% a
　　所有数据用SPSS13.0 统计软件处理,结果以±s表示。两组之间的比较用t检验，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。, Z& t' B1 e$ y7 ]$ V- X# }% |# @

　　2结果& l" E* [, H1 W
8 {% l1 E, g9 U7 V+ `
　　2.1倒置相差显微镜观察结果

! O, B5 [1 `1 q" i: Q3 k0 z& Y
) a# d' B) f- K8 {# |% P) a3 ?* i
　　刚接种的原代BMSCs呈圆形或类圆形,与周围的血细胞相混杂，大小不一,不能辨认细胞核。培养3?d首次换液后，可见短梭形及多形性的细胞贴附在瓶底，数量较少,散在分布。第5～6天细胞开始以集落方式生长,数量明显增多（见图1），随着培养时间延长，集落逐渐增大，12～14?d左右细胞可达90%的汇合，无接触抑制现象，细胞平行排列或漩涡状生长。传代后细胞很快贴壁，增殖迅速，呈长梭形，散在均匀分布，不再呈集落样生长，5～6?d可达80%～90%的汇合。实验组细胞增殖速度低于对照组，形态逐渐由长梭形向多角形、圆形转化，同时出现聚集生长的趋势（见图2）。对照组细胞基本保持长梭形，增殖能力旺盛，无聚集生长趋势。
. H6 C; {4 N8 b0 ^$ S7 e, Z' f
　　2.2甲苯胺蓝染色结果) b  o( Y8 T) O8 C* c

　　实验组可见大部分细胞胞浆内有紫红色异染反应（见图3）。而对照组仅有个别细胞被异染。

　　2.3Masson染色结果, \2 _( @0 K/ H; l0 v, f

　　实验组可见有大量胞浆被染为亮绿色的阳性细胞，胞核呈蓝黑色（见图4）。对照组中仅见极少量阳性细胞。# h4 I" L3 T5 z$ Z, }

　　2.4Ⅱ型胶原免疫组化染色结果
  M0 l6 N6 N3 {1 {. v
　　实验组中绝大多数细胞可见Ⅱ型胶原蛋白的表达，阳性信号主要位于胞浆内，细胞周围也可见少量弱阳性信号的表达（见图5）。对照组中仅见少量弱阳性信号的表达。

　　2.5培养液中GAG的含量检测结果4 _9 b( x0 p4 o
% Q9 f) G- }0 N& J2 g* _
　　见图6。实验组培养液GAG的含量随培养时间的延长而升高,而对照组GAG的含量未见明显升高。14?d时实验组GAG的含量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。" A/ ^. p& _4 K+ C
  ?# c4 r& o' Y1 ^& ~, G; C
　　2.6不同代次的BMSCs增殖能力和成软骨细胞分化率的比较分析由表1可见，多次传代后，BMSCs的增殖能力和成软骨分化的能力有降低的趋势。表１OD值Ⅱ型胶原阳性细胞率(略)$ y) U/ U) D, X2 l& j
$ d0 j6 Y- l9 x2 f
　　3讨论& v  e4 T8 I: u5 y2 _% w

TGFβ是一族具有多种功能的多肽类生长因子，是诱导BMSCs向软骨细胞分化的关键细胞因子之一。BMP2作为TGFβ超家族成员中生长和分化因子, 具有诱导体内成骨和软骨的功能［23］。体外研究结果表明，一定浓度的BMP2能在微团培养模式或支架材料如Ⅰ型胶原凝胶上诱导BMSCs向软骨细胞分化［4］，且BMP2具有提高TGFβ1合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的作用［5］。然而BMP2在单层培养模式下诱导BMSCs向软骨细胞的分化尚未得到充分证明。

本研究以兔BMSCs为实验对象，对上述问题进行了初步探讨。诱导培养14天后，取标本进行甲苯胺蓝染色、Masson染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色，结果证实诱导后的BMSCs分泌软骨细胞特征性的细胞外基质：Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。培养液中GAG的含量检测显示，实验组中GAG含量远高于对照组。提示BMSCs已分化为软骨细胞表型。对照组也出现极少量阳性细胞,可能与血清中未知生长因子作用以及较高细胞密度接种利于BMSCs向软骨细胞方向转化有关。1 B/ z# U* z: a  ~8 ]/ S: M

随着诱导时间延长，实验组细胞聚集生长，加强了细胞与细胞、细胞与基质间相互作用以及细胞之间的信号传递，有利于细胞基质的积聚，类似软骨胚胎发生前局部间充质细胞聚集，这种细胞聚集对于BMSCs 向软骨细胞方向分化有重要作用［6］。另有不少研究者采用微团培养来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态，但近来研究发现在微团培养时由于通透性降低, 细胞团块中心营养供应障碍，细胞增殖受限，不能满足较大软骨组织的构建［7］。与之相比，本研究采用单层培养模式存在上述问题，诱导后的细胞增殖能力较强，能够获得较多数量的软骨细胞，满足大量构建软骨组织工程的需要。( @- z& P, i) X# o! Y- m

细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化的影响尚不明确。霍建忠等［8］研究表明兔BMSCs第6、8代在成软骨诱导分化培养后蛋白聚糖的表达明显低于第2、4代细胞。本研究结果与其相类似，兔BMSCs第7代细胞与第2、4代细胞相比，蛋白聚糖的主要组成成分糖胺聚糖表达下降，另外Ⅱ型胶原蛋白的分泌亦有所下降。胡静波等［9］在无血清微团培养环境下诱导人BMSCs向软骨细胞分化研究中发现，随着代次增加，成软骨细胞分化的能力没有特别的差异。产生这种差异的原因可能在于：①胎牛血清中含有多种生物活性物质, 许多物质对细胞的作用尚不清楚, 血清在促进增殖的同时也可能促使BMSCs向成熟功能细胞分化，失去定向分化能力；②微团培养模式比单层培养模式在某种程度上更利于BMSCs向软骨细胞分化。另外，本研究用条件培养液对不同代次BMSCs进行培养后发现细胞增殖能力也有下降的趋势，可能与细胞不断分裂增殖，端粒酶的低活性表达密切相关［10］。此外血清中未知生长抑制因子、培养瓶表面残留物质的氧化损伤、操作过程中的各种机械损伤以及实验环境中紫外线消毒，都可能会BMSCs的增殖产生影响。. F$ k% W( l) x; S* Y" L! Q3 E/ Y
      【参考文献】
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% W( C0 b+ |5 h$ u) r( H& o
7 m; j9 G& z: v8 `
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　　［3］Na K, Kim S W, Sun B K, et al. Osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells in thermoreversible hydrogel constructs containing hydroxyapatite and bone morphogenic protein2 (BMP2)［J］. Biomaterials, 2007, 28(16):26312637.4 ^+ C* t* {3 g1 k/ H% V

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　　［4］Noth U, Rackwitz L, Heymer A, et al. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels［J］. J Biomed Mater Res A, 2007, 83(3):626635. " }5 h2 d+ c$ W( j3 h6 Y4 a

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　　［5］Toh W S, Liu H, Heng B C, et al. Combined effects of TGFbeta1 and BMP2 in serumfree chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells induced hyalinelike cartilage formation［J］. Growth Factors, 2005, 23(4):313321.1 u5 O, j7 j! o# Q4 K" E

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　　［6］Yoo J U, Barthel T S, Nishimura K, et al. The chondrogenic potential of humanBonemarrowderived mesenchymal progenitor cells［J］. J Bone Joint Surg Am, 1998, 80(12):17451757.. W# ]  z) [% K/ a3 O
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　　［7］段小军,杨柳,左镇华，等.应用聚集培养技术进行兔骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导培养［J］.中华实验外科杂志，2007，24（3）：316318.

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　　［8］霍建忠，陈峥嵘.细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响［J］.中国临床医学，2005，12(1):104107." H4 j  x! {6 |
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