督脉电针对脊髓损伤神经干细胞影响的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：耿直  杨晓娜　李志刚作者单位：新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830011；北京中医药大学针灸学院，北京100029
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      【关键词】督脉电针　脊髓损伤神经干细胞' t/ P% a* e* F! Q# |
   　　脊髓损伤（SCl）年发病率为20～40/100 万［1］，其所致的截瘫是一种比较常见的严重伤残，常引起各种并发症甚至死亡，给人们的生产、生活和国家的经济带来一定负面影响。督脉电针是中医治疗SCI的重要手段，并且有肯定的疗效，但是其机理尚不清楚，其对脊髓损伤后神经干细胞的影响，将为相关研究提供新的思路和途径。
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　　1神经干细胞的概念及生物学特性

　　1992年，Reynold等［2］首先从成年小鼠纹状体中分离培养出能在体外不断增殖、具有多种分化潜能的细胞群，由于其具有干细胞的特性，因此被称为神经干细胞（NSC）。该种细胞通常具有下列特征：⑴可自我复制和更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备；⑵处于较原始的未分化状态，无相应成熟细胞的特异性标志；⑶具有多向分化的潜能，即演变成不同成熟细胞类型的能力［3］。实验已证实［3］：在中枢神经系统内，一种被称为巢蛋白或巢素（Nestin ）的特异性蛋白可在神经干细胞的胞浆内表达，其属于中间丝蛋白家族，只在多潜能的神经外胚层细胞中表达。通过检测巢蛋白的表达即可确定多潜能干细胞的存在，因而巢蛋白是NSCs目前比较公认的特异性标志物。在成年哺乳动物的室管膜区、脑室下区、海马齿状回、纹状体、脊髓等部位都有NSCs分布。正常情况下，NSCs以静止、不增殖状态存在，并受生长因子、神经递质、周围细胞等内外环境调控，任何一方改变均可能导致NSCs激活［4］。基于以上对神经干细胞的认识，医学工作者们开始探索其治疗神经变性性疾患(如帕金森病、脱髓鞘疾病、脊髓损伤等)的可能。这种神经干细胞如能被特异性地诱导分化为某种特定神经元以替代丢失的神经元，无疑将为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新希望。如何诱导NSCs的增殖，促使其向神经元分化，以弥补缺损的神经元功能，为临床服务，成为NSCs研究的焦点。4 D: N4 D5 A+ j, d; v

　　2督脉电针对脊髓损伤大鼠神经干细胞的影响5 B2 Z% S( ?' u- U
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　　2.1督脉电针对脊髓损伤的治疗作用督脉电针是电针中最常用的一种。中医认为：外伤性截瘫伤其脊柱是现象，损其督脉是实质，督脉循行于脊柱正中，手、足三阳经均与督脉交汇，具有总督一身之阳经、调节阳经经气的作用。所以采用针灸治疗脊髓损伤时，督脉是首选穴位。针刺督脉直达病所，即能培补真阳，又可通经气使之上下贯通，阳气通达，则截瘫可愈，故治瘫首取督脉［5,6］。督脉电针不但可以调节督脉经气、疏通气血，而且还是一种脉冲电场，具有针刺和电场双重作用。电针治疗急、慢性截瘫已被临床所证实，李志刚等［7］对近十年电针治疗脊髓损伤的临床和实验研究进行了总结，发现电针对截瘫症、截瘫合并症包括痉挛、截瘫性疼痛、泌尿系统疾病等方面的治疗均取得良好效果，同时实验室研究中也证实电针可以通过促进电流、脊髓组织结构、诱发电位、酶、神经递质、神经肽、一些活性物质等的改变来促进损伤后脊髓的修复，表明电针可以阻止或减轻脊髓损伤后的继发性损害，从而减轻和缓解临床症状。有学者证实督脉电针可以起到对脊髓神经的保护作用和促进脊髓神经再生［8］。张志英等［9］通过研究电针对脊髓损伤早期caspase3 mRNA及蛋白表达的影响，结果发现电针抗凋亡的作用机制除可直接抑制caspase3的基因及蛋白表达外，还可能是通过机体的内在调节机制，以多途径方式抑制细胞凋亡，起到重要的神经保护作用。余安胜等［10］进行了督脉电针治疗大鼠半横断脊髓损伤的实验研究，依据联合行为功能活动记分、脊髓诱发电位检查、HRP逆行追踪标记三项指标联合评价证实：督脉电针能促进半横断脊髓神经轴突的再生。
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　　2.2督脉电针与神经干细胞移植的联合应用当脊髓损伤时，督脉电针治疗与神经干细胞移植之间有较好的协同作用。李晓滨等［11］研究了督脉电针与神经干细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢功能恢复的影响，将20只大鼠分为对照组、神经干细胞移植组（神经干细胞组）、督脉电针组（电针组）和督脉电针神经干细胞移植组（电针神经干细胞组），于胸10脊髓段做全横断损伤，其中神经干细胞组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞，电针组和电针神经干细胞组在术后开始接受电针治疗。经过行为学和电生理检测发现联合应用督脉电针与神经干细胞移植治疗的脊髓损伤大鼠，其后肢关节和肌肉活动、后肢攀爬运动、诱发电位潜伏期和峰峰值以及后肢肌肉萎缩程度等指标都得到较明显的改善，表明督脉电针治疗与神经干细胞移植之间有较好的协同作用。根据相关研究结果推测，督脉电针使脊髓损伤区及其邻近组织分泌的某些内源性神经营养因子作用于脊髓本身的神经元和投射到脊髓的神经元，使其受损伤的轴突再生。同时，移植的神经干细胞也受到内源性神经营养因子的影响更多地向神经元分化，并形成神经元网络或替换缺失的神经元，修复神经通路，结果脊髓损伤大鼠的肢体运动功能得到明显改善［12,13］。这一结论为继续研究督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能恢复的结构基础及其分子机制提供行为学依据。在此基础之上，李晓滨等［8］又对督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生进行了研究。在此研究中，大鼠脊髓全横断损伤处移植神经干细胞后，应用电针刺激该动物的督脉阿是穴、腰俞穴及长强穴一段时间，其脊髓横断处的去甲肾上腺素能、5羟色胺受体、生长相关蛋白43和降钙素基因相关肽能4种阳性神经纤维发生明显的再生。而且，去甲肾上腺素能神经纤维穿越脊髓横断处到达尾侧端脊髓组织，这表明督脉电针能促进脊髓横断处的去甲肾上腺素能神经纤维再生,联合应用督脉电针与神经干细胞移植后，去甲肾上腺素能神经纤维的再生更明显。这些再生的神经纤维生长机制可能与督脉电针直接或间接增高脊髓横断处邻近组织的神经营养素3(NT3)和环磷酸腺苷(cAMP)水平有关。已有许多研究证实，NT3对神经元的发育和分化及对损伤的中枢神经元存活及其轴突再生有重要作用［14］。神经纤维的再生有赖于其神经元胞体的存活，这是神经纤维再生的前提。同时研究也观察到，督脉电针与神经干细胞移植联合应用能更好地保护大脑体感运动区皮质和中脑红核内受损伤的神经元，而且有些存活的神经元发出的下行再生神经纤维穿越脊髓横断处到达尾侧端脊髓注射荧光金处，提示督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生。神经生长活性物质是促进脊髓神经再生的一种重要因素［15～18］。近年来，在应用细胞或组织移植修复脊髓损伤时，往往也同时应用神经营养因子，以增加移植区微环境的神经生长活性物质浓度［19］。据认为，这样更有利于移植细胞或组织的存活和分化以及脊髓受损伤神经元的轴突再生。在前期研究成果之后，李晓滨等［20］研究小组接着对督脉电针与NSCs移植联合应用促进大鼠受损伤脊髓组织产生神经生长活性物质进行了研究，发现应用督脉电针或联合应用督脉电针与NSCs移植后，受损伤的脊髓组织内cAMP（cAMP是细胞内重要第二信使)［21］，其作用主要是通过激活细胞内蛋白激酶A (PKA)后可以调控与细胞的能量代谢密切相关的2个步骤。受损伤的脊髓组织内cAMP水平在损伤早期已出现显著增高，而且NT3含量也有增加的趋势。这有助于理解先前研究［8,11］观察到的督脉电针与NSCs移植联合应用可能是促进全横断损伤脊髓结构和功能修复的一种分子机制。Trk是神经营养因子的高亲和力受体，NT3是神经营养因子的一个成员。而本研究则检测到督脉电针治疗后NT3和Trk在受损伤脊髓组织的水平有增高的趋势，这可能表明，受损伤脊髓组织经督脉电针治疗后出现了有利于受损伤神经元存活的微环境。  r) D" J1 F/ G' |
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　　2.3督脉电针对神经干细胞的作用国内一些研究者发现，利用电针可以影响内源性NSCs的增殖与分化。崔晓军等［22］研究了督脉电针对脊髓损伤大鼠神经干细胞的作用，将60只成年SD大鼠分为2组，每个时间段6只，于术后1、7、14、21和28天分别对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能后处死动物，应用免疫组化技术检测神经上皮干细胞蛋白Nestin的表达，采用计算机图像分析仪进行定量分析，研究结果发现，督脉电针能促进脊髓损伤后Nestin大量表达。这表明督脉电针对成年在体神经干细胞有很强的增殖作用。这是因为Nestin是神经干细胞的标记蛋白，分布在细胞质中，中等纤维骨架蛋白的表达在胚胎发育中往往与细胞的分化状态有关。Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失。巢蛋白基因可能主要在神经干细胞阶段表达。细胞免疫组化染色结果显示，巢蛋白在神经突及生长锥上存在较强的分布，表明它可能参与了有丝分裂后神经元与靶细胞之间神经联系的建立。从大鼠的神经病学评分来看，第14天单纯损伤组神经病学评分与督脉电针组比较，差别有统计学意义，表明督脉电针组大鼠患肢功能恢复，与Nestin升高同步进行，提示督脉电针促使Nestin表达增强，有助于脊髓损伤后神经组织的重建。单纯损伤组Nestin阳性细胞少，这可能神经干细胞在脊髓损伤病理情况下反应性增殖，以弥补神经系统组织学缺失。实验结果表明督脉电针能使大鼠损伤脊髓的神经干细胞的标记蛋白Nestin大量表达，并促进大鼠损伤脊髓的再生修复和功能恢复。陈雅云等［23］探讨督脉电针对移植在大鼠脊髓全横断损伤处的神经干细胞存活分化和迁移的影响。在研究中，将督脉电针作用于移植神经干细胞的脊髓全横断损伤大鼠，可以观察到督脉电针有促进移植神经干细胞在受损伤脊髓内存活的作用。这些存活的神经干细胞能够分化为神经元样细胞，有些神经元样细胞还长出有分支的突起。督脉电针能够促进移植的神经干细胞存活，并向神经元样细胞分化的机制，目前还不清楚，有可能与督脉电针增加受损伤脊髓组织分泌神经营养因子有关，因为神经营养因子具有调节神经元存活和生长的作用。神经干细胞的迁移在早期神经系统发育中起重要作用。当中枢神经某些部位发生病变或损伤时，必然会引起邻近与其相关部位的神经元损伤甚至死亡。因此，可以通过移植神经干细胞或内源性神经干细胞的迁移，并分化为神经元，去替换因病伤而死亡的神经元。结果观察到，督脉电针对移植在脊髓全横断损伤区内的神经干细胞向宿主脊髓组织迁移方向有一定的影响作用。研究认为这可能与所选穴位有关。本研究选取的督脉阿是穴在脊髓横断处头、尾端各一（第1组穴位)，而长强穴和腰俞穴（第2组穴位）均位于脊髓横断处的尾端。这两组穴位的分布可能对移植神经干细胞的迁移方向造成一定的影响。一般认为，电针的脉冲电磁场可使神经元发生有效极化，使其酶的活性增加，轴突运输加强，代谢旺盛，有利于受损伤神经元的轴突再生；轴突内带电蛋白质受体在电针的电场作用下可发生定向移动，这些受体可以影响神经元的发育和生长，加速轴突再生和功能恢复。因此，神经干细胞的迁移方向也可能会受到电针形成的脉冲电磁场的影响。( x  I' f- A% Y1 H9 k

　　2.4电针对脊髓损伤后神经干细胞增殖与分化影响的应用前景综上所述，督脉电针可能通过促进受损伤脊髓组织细胞的代谢过程，引起细胞膜的腺苷酸环化酶活性升高，使ATP生成cAMP增加，从而激活神经元和神经胶质细胞内蛋白激酶A的级联反应，在增强细胞代谢的同时，启动神经营养因子和细胞生长因子等蛋白质的合成和分泌过程，从而促进脊髓内移植的神经干细胞存活和分化，以及促进受损伤神经元的存活及其轴突再生，重建神经通路，恢复脊髓功能［24］。研究表明，电针治疗早期脊髓损伤，可明显改善损伤局部血流量，清除氧自由基［25］，提高神经营养因子的表达［19］，促进成体神经干细胞增殖［22］。提示电针既能激发内源性神经干细胞的增殖，可以使与神经系统生长发育及神经可塑性有关的巢蛋白的表达保持在较高水平，又能改善损伤局部的微环境，促进神经营养因子的分泌。电针治疗促进神经细胞的代偿性修复，减轻神经功能缺损和病理损害程度。总之，电针在诱异NSCs增殖和分化上显示出巨大的潜力，随着人们对电针对神经干细胞作用研究的不断深入，检测的实验手段不断更新，督脉电针对脊髓损伤后的治疗在基础及临床的探索方面必将显示更为广阔的前景。2 r+ Z) c3 L8 V$ g3 B
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