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作者：何伟， 沈铁城，狄荣科，杨勇，张志坚作者单位：(江苏大学附属医院骨科， 江苏 镇江 212001)
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1 `: N e/ g8 w. @ 【摘要】 目的： 探讨褪黑激素（melatonin，MT）体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法： 采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs，以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3，7，10，14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin) 、神经元细胞特异性标志(neurofilament, NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果： MT诱导分化3 d，部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin, 7～14 d表达 nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论： MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。
0 c6 P6 T: l- [6 U" v 【关键词】骨髓间充质干细胞； 褪黑激素； 神经细胞! ?# K! ]/ Q& O' J7 y5 ?2 X
In vitro melatonin induction of differentiation of marrow$ @+ b8 ]9 q1 {" x9 U) z2 W
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mesenchymal stem cells/ B* C7 r2 G3 Z6 f/ R" I/ X/ c
9 E5 B$ k# \$ v6 O6 @( [ HE Wei, SHEN Tiecheng, DI Rongke, YANG Yong, ZHANG Zhijian
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2 n5 R4 \2 y J! Y9 D3 j (Department of Orthopedics, Affiliated Hospital, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001,China)( M' z4 [8 d; w, p; s, h
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［Abstract］Objective: To explore MT introduce marrow mesenchymal stem cells into neurons on different time. Methods： By using cell culture method, rat MSCs were isolated and purified, The rat MSCs were induced with MT.The expression of nestin,NF and GFAP in the differentiated cells was detected by immunofluorescence after introduced 3,7,10,14 days.Results： Three days after induction with MT some neurons were found to contract, refract more light and protrude and bulge.Some neurons contracted to atriangular shape, and some others became simple bipolar or multipolar cells. After being induced for 3 days, the cells expressed nestin.After 7～14 days, the cells expressed nestin and NF, but didn′t express GFAP.Conclusion： MT can introduce MSCs into neurons.
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［Key words］bone marrow mesenchymal stem cells; melatonin;neuron
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脊髓急性损伤是中枢神经系统的一种严重创伤，近来对于其治疗的研究主要在于干细胞的移植。骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是指一群具有多种分化潜能的成体干细胞, 在适宜条件下可向神经细胞分化。MSCs因其来源广泛、取材容易、可自身获得、体外扩增能力强、能在体外表达多种外源目的基因, 并可在中枢神经系统内存活与迁移等优点, 为神经系统疾病的细胞治疗和基因治疗提供了新的思路［1，2］。本实验拟在不同时段检测褪黑激素（melatonin, MT)体外诱导MSCs向神经元细胞转化过程中细胞的转变，以便获得更好的诱导途径，从而更好地治疗脊髓损伤。" A( b1 v! }" c7 B$ P5 H
* Y4 M6 j' Y; S0 F' x6 L( h 1材料与方法
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3 C: r! t J( J! P- a' f. ]8 C 1.1动物、主要材料及仪器+ {3 P, Y$ E/ c! _. j
9 C5 m! w n7 N' U0 F健康雄性SD大鼠，体质量约100 g(江苏大学动物实验中心提供)；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；Cy3标记的羊抗兔IgG、 MT（Sigma公司）；兔抗大鼠神经元细胞特异性标志（neurofilament,NF)单克隆抗体、兔抗大鼠星形胶质细胞特异性标志(GFAP)单克隆抗体、兔抗大鼠NSE单克隆抗体(博士德公司)；CO2细胞培养孵箱；超净工作台。, R& E/ I8 M* |! t7 G G
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& ]# j8 v3 i' ?& e 1.2 方法( D3 l" O% N, b+ ?
8 g$ I5 _2 D* i& s 1.2.1MSCs的培养和纯化8 d8 c1 `- e: Y9 z: S
% M3 F" b, ?) p9 Q/ e 采用密度梯度离心与粘壁培养法相结合分离扩增和纯化MSCs。
% l0 K" |# T4 _; W. P$ }& J% ?: P* X& z( E6 s. E
1.2.2MSCs向神经元样细胞的定向诱导分化
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第2代MSCs 按1104/ml浓度接种于铺有22 mm22 mm盖玻片的6孔板中,培养液改用DMEM 20%胎牛血清,待细胞融合达90%后,培养基中加入MT 10 mol/L为实验组，对照组不加诱导剂。* J$ k2 M2 c2 n" }3 G
: E; Q5 t' `$ @* |& T' g, U 1.3观察指标9 W' l h9 o: r% P) v/ O
* j/ ~& r$ H5 F% w 1.3.1倒置显微镜观察
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W- R& x8 \' v$ o4 M+ `9 |0 H 逐日观察细胞形态变化, 并统计不同时段各组细胞分化率(分化率=2个以上突起细胞/视野内全部细胞100%), 采用SPSS11.5统计软件中的方差检验,P4 H2 ]$ t/ o' q) N- B$ X
. Y& X" w' M4 k 1.3.2免疫荧光法测定" Y4 a1 X& M( `
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分别在诱导后3，7，10，14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志（nestin），NF，GFAP的表达。
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2结果
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& n1 Z& @, n$ M& w- `% D c% c 2.1细胞形态学观察$ f! `7 J$ ]5 L# T5 J7 D
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在诱导前, 大鼠MSCs 以扁平、梭形为主, 有些呈圆形、多角形, 少数有短小突起(图1a)。诱导3 d后, 见部分细胞胞体收缩,折光性增强,伸出突起,部分胞体收缩成三角形或成为简单的双极、多极细胞(图1b)。7 d后较长的突起末端形成生长锥样的膨大, 呈现神经元样的形态（图1c）。10 d后神经元细胞数量增多，细胞突起延长（图1d）。14 d后, 神经元样的细胞数量进一步增多, 且几个细胞的突起之间互相连接成网状（图1e）。" j: {" J5 u4 W! v* u$ A9 ~8 p
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2.2倒置显微镜观察计数
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5 M1 W0 X B2 e" @统计不同时段各组细胞分化率,其随诱导时间的延长而增高，至诱导14 d时达到53.43％。各个时段间比较P( ^3 S, l& d) ^& N
- u7 \6 k% C1 v$ m5 L) Z! G 2.3细胞免疫荧光测定
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* N/ F% ], a2 P0 C 实验组在诱导3 d后细胞表达nestin（图3a），而不表达NF，7 d后可同时表达两者（nestin图3b，NF图3c），GFAP在实验过程中始终不表达，随着诱导时间的延长免疫荧光呈阳性的细胞越来越多。3 Z0 @; e3 e) X/ k% n' `
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3 讨论
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# [7 ~: _9 i& t; e脊髓急性损伤是中枢神经系统的一种严重创伤，据有关资料显示，在脊柱骨折中约有16％～40％并发不同严重程度的脊髓损伤，脊髓损伤的恢复极为困难，其致残率极高，是目前临床危害伤者身心健康和增加社会负担的严重伤害性疾病。传统治疗脊髓损伤仅限于脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗，疗效较差。近期有研究观察到骨髓间充质干细胞可以在体外诱导向神经元细胞分化，启发临床工作者采用移植骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的新思路［3］。作为供体细胞，骨髓间充质干细胞具有胚胎干细胞和神经干细胞所无法比拟的优点：可以很容易地从成人体内获得骨髓细胞并且对成人不会造成危害；自体移植也克服了使用胎儿组织所带来的伦理和免疫学方面的问题。# V$ E. [ {3 R) N: x8 M Q& r
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MSCs来源于中胚层发育的早期间充质干细胞,文献报道其具有多向分化潜能,甚至可跨胚层分化为外胚层的神经细胞和神经胶质细胞。Woodbury等［4］体外应用β巯基乙醇或二甲基亚砜与丁羟茴醚,可将 MSCs诱导分化成神经元样细胞,并表达神经元特异性蛋白;赖贤亮等［5］应用β巯基乙醇诱导MSCs 6 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,分化后的细胞可见NF，NSE表达;杨立业等［6］提出具有抗氧化剂作用的中药丹参、参麦、黄芩均可诱导MSCs向神经细胞转化,在最适合条件下转化率可达50%～60%;项鹏等［7］提出:人MSCs采用含腺苷酸环化酶激动剂Forskolin及磷酸酯酶抑制剂(IBMX)可诱导MSCs分化为神经元,提示胞内CAMP浓度增加可诱导人MSCs分化为神经元样细胞。而MT可促进多种细胞分化，而且有助于幼稚细胞的分化成熟，保护中枢神经系统的神经元及促进神经细胞生长。
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本实验在MT诱导的作用下,在不同时段研究MSCs向神经元细胞的转化。在诱导3 d后细胞表达nestin，而不表达NF，7 d后可同时表达两者，GFAP在实验过程中始终不表达。在形态学上诱导4 d后，呈神经元样细胞形态,细胞突起增多,折光性增强。表明MSCs在MT诱导向神经元细胞转化过程中，先向神经干细胞转化，后向神经元细胞转化。本实验初步的研究结果表明，MSCs在MT的诱导作用下可以分化为神经元细胞，为更好地研究骨髓干细胞向神经元细胞转化提供了一定的实验基础。
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（本文图1，图3见彩色插图）
( I, F# z" g3 X3 I- X _8 E v; h6 b 【参考文献】- M3 D" e$ L1 j D, d
［1］Long X, Olszewski M, Huang W, et al. Neural cell differentiation in vitro from adult human bone marrow mesenchymal stem cells ［J］.Stem Cells Dev,2005,14（1）:65-69.
/ G) b& b. @! ?8 Q$ f+ z( y% B9 k+ q' ~5 i& ^4 v( Z
X+ M/ E: x$ V4 B
$ L$ R' E2 q% j ［2］Mimura T, Dezawa M, Kanno H, et al. Peripheral nerve regeneration by transplantation of bone marrow stromal cellderived Schwann cells in adult rats ［J］. J Neurosurg, 2004, 101(5):806-812.
) O# F4 o6 K* Q. x& P% S9 Z5 C, r0 I
: T/ `. c# S* P# p# f+ N1 O" r8 A
: C) q5 q z. d7 q- s+ V O ［3］Dezawa M. Insights into autotransplantation: the unexpected discovery of specific induction systems in bone marrow stromal cells ［J］. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(23):2764-2772.( S) q" u4 u2 ~1 w! v
: X: |9 n L8 w; }
$ a) i3 V0 @ X" ]. X6 @7 c" A0 I/ ^9 R2 H" A' B
［4］Woodbury D,Schwarz EJ,Prockop DJ,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370.0 s4 I, ? k, J/ g
: B4 j$ I w6 X/ j" U: `5 w
* Y; S/ J! b& n5 D
8 H3 T. H) \8 x: j ［5］赖贤亮,邓志锋,汪泱,等.β巯基乙醇诱导成年鼠骨髓基质细胞分化的研究［J］.江西医学院学报,2003,43(2):18-20." O, {2 N- m, \9 Y7 C6 X
! v9 O, C) z! J, U) N$ L3 r. u! }5 O* p) E& D0 C
- w: f# g+ V+ S ［6］杨立业,刘相名,惠国桢,等.丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化［J］.中华神经外科疾病研究杂志,2003,2(1):29-32.
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, d$ ^- e' j# J. o! J ［7］项鹏,夏文杰,张丽蓉.胞内cAMP浓度的增加可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞［J］.中国病理生理学杂志,2002,18(11) :1324-1327. |
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