神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究 - 国内文献区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

12 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 25 下一页

返回列表

查看: 525110\|回复: 243	go 神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究 [复制链接]

文献管理员

版主

Rank: 7 Rank: 7 Rank: 7

积分: 8
威望: 8
包包: 898

楼主

发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：张立峰，茅祖斌，蒋赞利作者单位：东南大学临床医学院,江苏南京  210009

   * e* S0 q* q$ S( j  ~! o

                     3 P2 V6 B# A! X3 T% C

                  7 j' p* O) p1 Z' z
         & y* \, i% f3 B  u: n8 L

      % q" k& z6 x5 r0 o1 z4 b% Q, E
      3 k3 @7 M, S! E' A- V

      【摘要】  目的：探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。方法：66只SD大鼠随机分为假损伤组（A组）、SCI对照组（B组）和细胞移植治疗组（C组）3组，应用已包被多聚左旋赖氨酸(PLL)的SPIO标记NSCs,对标记细胞进行普鲁士蓝染色，分别在细胞移植后第1、2、3、4、5周对各组动物进行BBB评分，细胞移植后1、3、5周行MRI检查。结果：(1)普鲁士蓝染色证实该方法标记NSCs的有效率为100%。（2）细胞移植后1～5周,B、C组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。（3）1.5 T MRI 检查见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变。结论：MR技术可以活体追踪干细胞，NSCs移植治疗SCI有利于大鼠后肢功能的恢复。
      【关键词】脊髓损伤；神经干细胞移植；磁共振成像；大鼠
   脊髓损伤(spinal cord injury,SCI) 后自身的修复能力非常有限,死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究改变了这一观点。NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞,是神经系统发育早期特定的细胞群体,它具备干细胞共有的特点，即能长久地保持增殖和分化能力［1］。随着分子影像学的发展,干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个突破点［2］。本研究利用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide,SPIO) 标记NSCs,对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪,探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。

1材料与方法! F8 }2 R6 _, ]' [; V
3 u- A2 y: t0 U* C* N( j; s
1.1胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定［3］
* F9 h9 f2 w! w* a+ p5 h  r5 [
取胚龄14 d SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,以1105ml－1种瓶,用DMEM/F12(1∶1)无血清培养基［内含bFGF 20 ng·ml－1、EGF 20 ng·ml－1、B27 20 ng·ml－1］培养。每6～7 d换液、传代1次。  K5 {$ F, D9 o
  L3 D) g3 A; A* R1 k3 d  E+ E
对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原,室温孵育30 min,吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 ℃孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗,室温孵育1 h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。- h: p  J1 G, N4 A  V3 O

1.2NSCs的标记和染色
2 _: F, q1 J6 m& g$ r
细胞传至第3代,取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培养基中,37 ℃振荡60 min,使SPIO终浓度为25 μg·ml－1,将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12 h完成标记。
- K  N# \% K/ Z( T
NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10％血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7 d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤3遍,含2％亚铁氰化钾的6％盐酸溶液常温孵育30 min,显微镜下观察。
0 e* y' h; h$ n8 o! @; y
1.3实验动物分组与SCI模型的制作0 h' G6 l0 [. A
% V& t2 {) ~# O1 H' O$ Q
66只成年雄性SD大鼠,体重250～300 g,随机分为假损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法［4］制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠(30 g·L－1)按40 mg·kg－1腹腔注射麻醉,背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上,常规消毒,腰背部正中切口,逐层分开显露T8～T10椎板,行T9全椎板切除,显露硬脊膜,钳夹固定T8及T10棘突,用10.0g的不锈钢棒(直径为2.5 mm)沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落,打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上,后者将打击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开打击物,逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2 ml,以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染,每天1次,持续3 d。注意保温,分笼饲养,自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩协助排尿,直至建立反射性排尿。1 S3 @2 M! o% X( V

1.4细胞移植

将第3代悬浮培养的NSCs悬液用台式离心机离心5 min(1 000 r·min－1),将细胞团以少量培养液吹匀,细胞计数为105μl－1。C组动物SCI后9 d于损伤节段下0.5 cm处用5 μl微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中,注入2 μl NSCs悬液,逐层缝合切口。
' y2 [  p& i2 f9 q3 w
1.5运动功能评分8 d, q9 n9 b+ ?' ~2 U; g
- L1 K) `& G9 B8 o5 F* |
BBB评分［5］为总分21分的运动功能评分,考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置,表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观,易于掌握,与脊髓功能恢复有极好的一致性。分别在动物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周进行盲法BBB评分,由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。将动物置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 min,记录动物后肢运动情况。, B# W* W( o9 W) C7 I( K* g0 _" ^7 }
, |' A; z% V# e) T( y2 c! g
1.6MR检查$ }5 |6 q5 v0 ?0 |( n
3 l5 h1 ?+ e0 P
于术后第1、3、5周分别行MR检查，扫描序列为T2WI。麻醉方法同前。9 }: y$ J6 {5 T9 b' L

1.7统计学处理7 Q4 m, D+ y: c9 o+ ?2 B
& c% _1 H% @7 V
所有数据以x-±s表示,采用SPSS 12.0统计软件处理,组间比较采用t 检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。
6 e( F% @% Z& [" t+ Y, v
2结果* ?) P! B6 i) O' Z/ ^1 S7 O5 _
2 q3 x+ ^1 K+ j3 O* @' I
2.1NSCs的培养和鉴定情况

2.1.1细胞培养NSCs在无血清培养基中进行体外培养,能保持其未分化的多潜能状态,换液后细胞生长迅速。培养1周左右,随着NSCs的不断扩增,形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。# ?1 [$ p0 b; C: r
: n1 c" S: [; r/ n; e; Z% o
图1培养7d时NSCs于无血清培养基中

形成的神经球200; o+ D! }9 S" s# Y
. }& q2 a$ n- t7 \
2.1.2NSCs的鉴定NSCs是一类未成熟细胞,选择性地表达某些抗原标志,如巢蛋白(nestin,属中间丝蛋白)。本实验巢蛋白免疫荧光检测结果示神经球有明显的荧光(图2，见封二)。

2.2普鲁士蓝染色结果! F5 f3 n3 a6 o" _% I3 E9 e
' d: {  [* S2 u  V- M* m. K+ L/ A
显示100％的NSCs胞质内有细小的蓝色氧化铁颗粒（图3，见封二）。
0 q% S; @3 ]/ s
2.3运动功能评分

见表1。所有动物在损伤术后1 d双下肢全瘫(BBB评分为0),随后BBB评分有自发恢复,实验选用的大鼠在SCI后第9天BBB评分＜7。A组大鼠在各评分时间点均为21分。细胞移植后1～5周,C组与B组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。表1不同时期各组BBB评分结果$ C0 c# ]0 q4 t2 l. M0 W( f
9 V$ O. ^. b/ T
2.41.5 T MRI

将SPIO标记的NSCs移植到C组SCI下位1周后行1.5 T MR检查,见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变（图4）。

图4NSC移殖后第5周在SCI部位有低信号改变
" K, V# U4 I! Z9 l7 U3 K7 K
3讨论

SCI是一类中枢神经系统严重的致残性疾病，过去认为中枢神经组织不可再生，因此对SCI的治疗显得束手无策。但自1992年Reyonlds等［6］首次报道体外成功分离神经干细胞至今，中枢神经系统不可再生的观念已彻底被打破。NSCs的出现为SCI的治疗带来了希望。在大量的SCI实验研究中，对NSCs的应用主要集中于单纯的NSCs移植、以NSCs为载体的转基因治疗及NSCs联合生物材料的应用3个方面。本实验就是对单纯的NSCs移植治疗SCI进行进一步验证。应用NSCs治疗SCI的本质是实施细胞替代（cell-replacement），通过移植的NSCs大量增殖分化，替代损伤的脊髓组织，重建神经通路。提高NSCs移植后存活率并定向调控其向神经元分化是现今研究的重点。SCI后的脊髓内环境不利于NSCs的存活及分化。实验发现SCI后产生大量的神经毒性物质，例如IL- 1、IL- 6 和TNF- α，这些神经毒性物质导致了移植的NSCs死亡或分化成为胶质细胞，这些物质在损伤后24 h内大量产生，24 h后开始减少，选择合适的移植时间将会显著提高NSCs的存活率并促进其向神经元分化［7］。Coumans等［8］也发现SCI后6周行胚胎脊髓移植能促进脊髓再生并使后肢功能得到明显改善。Okano等［9］认为SCI后存在一个“窗口期”，在“窗口期”内进行NSCs移植治疗SCI可能取得更好的效果，窗口期大约在SCI后的7～14 d。延迟移植明显提高了NSCs的存活率，一定程度上促进了NSCs向神经元分化。但是时间过长损伤处形成瘢痕细胞又难以修复。另外，Suzuki等［10］发现，NSCs球较单层培养的NSCs在SCI后移植存活和移行能力更强。本研究对SCI模型造模后9 d移植NSCs，此时急性炎症已消退,微环境进入修复阶段,有神经生长、营养因子的表达及微血管的形成,有利于移植细胞的存活。同时，NSCs分泌的神经营养因子有利于轴突再生及突触形成。观察BBB评分发现，NSCs治疗组神经功能恢复明显好于损伤对照组，差异有统计学意义。+ \: N) S8 G5 q' S- p
: U, v, L+ |8 s
开展干细胞治疗的挑战之一就是移植后干细胞的分布和归宿。在中枢神经系统的不同病理、生理条件下,移植的NSCs有着不同的迁徙和分化能力,对干细胞这一特性的研究目前多为在移植后的一定时间内处死实验动物,对神经组织进行切片。而这些侵袭性的方法,不能对NSCs在同一动物体内的迁徙、增殖情况进行动态的观察,故需要非侵袭的手段来对移植入体内的NSCs进行监测。MRI可以提供25～50 μm的分辨率,接近单一细胞的水平,使其理论上可以用来对移植的细胞进行活体示踪。应用新型的MRI对比剂SPIO标记NSCs,以其独特的超顺磁性,利用MRI可以对NSCs移植后的迁徙、增殖情况进行动态观察。SPIO为一种颗粒物质,是一种新型的MR细胞内对比剂。作为超顺磁性MR对比剂,它可以影响局部磁场均匀性,同时产生磁化率效应(susceptibility effect),从而加速共振质子的失相位,使T2弛豫时间显著缩短,此类对比剂的T1效应相对较弱。SPIO是由晶体氧化铁作为颗粒核心,用稳定剂如右旋糖酐(又名葡聚糖)或羧葡聚糖膜所包裹。它主要通过以下3种机制选择性标记干细胞：（1）直接胞吞作用：将被葡聚糖包被的SPIO直接放入培养基中,与用于移植的NSCs共同培养,标记细胞。（2）受体介导的胞吞作用:在已进行的研究中,SPIO颗粒多与转铁蛋白共价结合,结合后的复合物放入培养基中和干细胞共同培养。（3）转染试剂转染后介导的胞吞作用：一种是阳离子物质转染后介导的胞吞作用，另一种是脂质体介导的胞吞作用。本实验在NSCs移殖后3～5周行MRI检查SCI部位可观察到低信号改变。表明NSCs可以定向地向损伤区域迁移，此时BBB评分显示细胞移殖治疗组与损伤对照组有显著性差异，说明随着移殖细胞向SCI区域迁移数量的增加，大鼠运动功能也得到明显改善。利用这种非侵袭的方法，对移植入体内的NSCs进行动态监测。此项技术应用于临床，对移殖的干细胞进行标记，无创检测移殖的细胞在体内存活和迁移的情况，同时与功能评分相结合，可以对研究和治疗对象进行实时、持续的观察。7 @& h6 N2 g  d

随着干细胞移植技术的日益成熟、干细胞标记技术研究的深入以及MRI技术的迅速发展,可以预期该项研究将会对SCI的治疗产生深远的影响,对神经康复医学及医学影像学的发展作出巨大的贡献。
      【参考文献】
［1］GAGE F H.Mammalian neural stem cells ［J］.Science,2000,287(5457):1433- 1438.5 \  }7 ?$ [- e/ }' Y/ ^7 f& t& ]
% o' O$ i: ^. \  R8 ]+ m+ u
% ~7 Z3 l4 x4 T4 @; ~# I% O( H

［2］ARBAB A S，BASHAW L A，MILLER B R，et al.Characterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with superparamagnetic iron exide nanoparticles and transfection agent for cellular MR imaging［J］.Radiology,2003,229:838- 846.0 M1 C  K7 q: \
/ ]: w; V9 F- w) s2 w

: K) ?0 J) f" H5 {2 ]( g( ^! B$ R+ b
［3］唐少锋,汤逊,蔡景霞,等.人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究［J］.中国脊柱脊髓杂志,2003,13(9):523- 525.$ l1 B' U5 k) m  ^% H# `

* N' x. C8 s- f9 ^
［4］KHAN T,HAVEY R M,SAYERS S T,et al.Animal models of spinal cord contusion injuries［J］.Lab Anim Sci,1999,49:161- 172.9 r6 Q4 m5 s& j; G$ i) g
1 l/ x; n; \: s4 K3 T: \7 d

［5］BASSO D M,BEATTIE M S,BRESNAHAN J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma,1995,12:1- 21.

［6］REYONLDS B A,WEISS S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system［J］.Science,1992,255:1707- 1710.

( P. v9 h: R$ q
［7］NAKAMURA M,HOUGHTLING R A,MACARTHUR L,et al.Differences in cytokine gene expression profile between acute and secondary injury in adult rat spinal cord［J］.Exp Neurol,2003,184(Ⅰ):313- 325.( \( U& h: N  U# A: l4 J

［8］COUMANS J V,LIN T T,DAI H N,et al.Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transaction in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins［J］.J Neurosci,2001,21：9334- 9344.
& M: D" N  i- z9 M8 T
% S# f7 H  R" x6 w- @

［9］OKANO H,OGAWA Y,NAKAMURA M,et al.Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury［J］.Semin Cell Dev Biol,2003,14:191- 198.

$ s- s) f8 x9 Y6 K+ ?2 g1 h
［10］SUZUKI Y,KITAURA M,WU S,et al.Electrophy-siological and horseradish peroxidase-tracing studies of nerve regeneration through alginatelled gap in adult rat spinal cord［J］,Neurosci Letters,2002,318：121- 124.

收藏0 分享0 顶0 踩0