MTT实验接种细胞不均匀

聪明的一休哥

请教大家做MTT实验时，往孔板接种细胞时候的注意事项以及技巧。
9 W; ]( c/ @  r0 K1、细胞选用的是小鼠成纤维。
) x; m+ B. u; B# H/ b* M/ c2、要求每孔接1000个，但是感觉太少，我一般接1800~2000个左右，因为血球计数板也比较破 国产的很便宜那种。也不知道计数的误差有多大，而且计数板也有个范围么，数量太小肯定也不准，一般密度大的时候计两次，再稀释。' ^! ^  t2 r1 m
3、计数后，把悬液倒在板槽里，用八排枪加样，每孔100ul。加之前反复吹了（Thermo S1移液器）加的时候每次加之前都会用排枪反复吹三四次。
' y  A( S5 c  Z& p4、加样并不快，一般从孔的边缘加，但是会有气泡。9 {2 e; t/ g; r/ p
5、接种后放置两三分钟，镜下看孔间的密度有差异，而且一个孔的也不均匀，集中在中间。) O8 U. j* h5 r. w- N* ^0 c5 m
请教各位怎么办？+ M  @0 N( z) i5 e% g& l
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显微镜调好以后，移动培养板的位置，一开始这个视野清楚的，换个视野就模糊了又要调焦，这个是怎么回事设备太破了吗？）

tingting2113

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1、任何技术方式都会存在误差，血球计数板也不例外，但是应该不至于会影响你的实验。+ A7 ~+ ]0 L' D6 p2 x
2、我做MTT的时候没有用排枪，和你的方法一样，也是从孔的边缘加。如果不嫌麻烦可以试试不用排枪，一个一个，每次加都吹打几次，看看会不会好一点。
. W, }' s& A( [( |7 {3、MTT法对接种的是不是均匀影响大吗？这个不是很了解。如果都集中在中间有可能是由于液体的表面张力，还有可能你看看你用的孔板，是不是平底的。' n( g- q: |0 w  Y
4、显微镜就是需要随时调焦的，这个正常，不是设备的问题，如果换视野微调就可以了，也不麻烦。/ O7 [9 |, a! b5 I" r

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子! H6 S, e" |. N- l* @8 [' s

3 y0 ?# L+ N, T! B& J) p非常感谢。
/ P- K* |  Q* M  m1.计数板的问题确实不是大问题。8 J; m: K9 \! @  m* y' O* {) q
2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。# I6 A  f& z' ?7 @3 a7 R' h+ S/ _
3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。/ \; }% |& u4 h6 |0 a) e2 }; ?1 V. |
4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。/ [  Z; `; `' g5 n3 l1 L5 k4 g8 V5 c. x
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子0 J" q- U, ]4 U  T+ g: h
% h. z4 D  w, h  D
非常感谢。
( j4 E+ `2 c: G! [/ O2 U5 N+ l/ ~6 A1.计数板的问题确实不是大问题。
( R/ M0 s) x7 R! ^6 U5 l# ?2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。
9 v0 g3 [* [0 n% W" W- b3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。
4 c) ]8 j5 A4 t* g+ `& _4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。, [5 b- ]' q$ ^& z( b8 s2 p
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

genhaoxin

计数板对结果影响不大，即使在精确也有误差，重要的是保证每孔细胞量一致。你用排枪吹打混匀，那么细胞悬液的容器应该是培养皿之类的了，细胞悬液混匀效果估计不好，建议离心管装细胞悬液，移液管混匀，不用排枪，单孔加液，加两三孔混匀一下。之前用过排枪，感觉不是太一致。