小弟向版主及各位PCR高手求助，帮忙解答，谢谢~

caifranklin

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版主你好，我想请你帮帮忙解决下克隆的问题，我们最近在克隆Lats2（ORF:3129bp）是Hippo pathway的核心基因，但是一直都克隆不出来，设计的引物是从NCBI上找到其mRNA，然后在取了他的ORF并选取其首尾的两端20bp序列定为primer并加了保护序列6bp和酶切位点6bp。可是各种PCR的条件和程序都试过了，可结果都没有目的条带，而出现很多杂带，找不出原因。求解啊！感谢！

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回复 caifranklin 的帖子% p. B* S( j  Z) ~7 H
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我看到你的帖子，你的目的好像就是PCR Lats2这个基因的mRNA是吧?前段时间我们实验室刚好做完这个实验，我们也遇到这个问题了，假如这样的话就必须做RT-PCR,而且我们做的时候发现买的盒子里的Taq酶有问题，死活都PCR不出目的片段，你可以试试买新的Taq 酶。至于你所说的杂带，你可以再Primer blast中看看你的引物的特异性。

Dongqin11

首先，你这个primer设计也太简单了吧，现在市面上不是有很多引物合成软件吗？比如那个vector，primier,oligo等等。而且对于你设计出来的引物有很多要求，比如其GC含量以40-60%为宜，引物对应模版序列的Tm为72最好，选择引物二聚体及发夹结构能值最低的。引物3’端一定要与模版完全配对，不能出现3个连续碱基，末端避免使用A。: E$ a' M0 y* C% J) m  A
还有，我不知道你的目的区域有多大，当你的目的区域小于200bp时扩序要加大，引物尽量向两边移，要挑两边特异性最好，Tm最适合的。
: X& Q! |- d+ y; R& F7 n- k3 t最后，一般PCR时在条带最下面可能会有两条杂带，一个是引物二聚体，还有就是dNTP。如果你还有其它杂带，那只能说明你的引物特异性差，p出其它部位的片段。

caifranklin

感谢各位大神的指点，我们实验室的引物都是这么设计的，之前师兄也是，他的20多个基因都批出来了，可惜我的碰上了麻烦。我也提出过换引物，可是老板坚持说是我们使用条件没摸清楚，酶也是换过了最好的NEB的了，各种酶都试过了。现在能批出条带的已经是唯一能用的酶了。其他的都批不出东西……blast的结果显示，引物的特异性明显很差，二聚体的几率很大，但是老板就是不想换引物……悲剧啊，在此条件下，各位还有什么高招没？跪求援助啊！不胜感激！

caifranklin

同时感谢版主的鼎力帮助！谢谢！& u& G% [: Q9 ?" h

sanna1

pcr 无非是两个主要问题，pcr 条件和引物。你好象是引物问题，如果你确信酶和条件没问题，只能在引物上下功夫了。要说服老板换引物。引物现在很便宜，多试一试。 要不把你要扩增的序列放在这儿，让各位高手看一看。- n' ]& q- ]# L3 t
pcr看是简单，但有时就是不出来。我们科曾有一个罗马尼亚姑娘，设计了20多对引物多没有work, 后来换了一个日本人，两队就出来了。

细胞海洋

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你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
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. q, P+ r5 R  `) G) n  S" v否则他会看不到

Dongqin11

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你可以试试两步法PCR，不用设退火温度。其它都一样。

caifranklin

好像是我的权限不够啊，不能针对性的回复各位哦，版主求助！

细胞海洋

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可以的
3 [& P  m! d2 ~) ?
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他上线会有提醒